راهنمای جامع آشنایی با روش‌های مختلف توالی یابی DNA

وقتی پروژه ژنوم انسان (Human Genome Project یا HGP) در سال ۲۰۰۱ اولین پیش‌نویس توالی ژنوم انسان را منتشر کرد، بیل کلینتون رئیس‌جمهور وقت آمریکا آن را «شگفت‌انگیزترین نقشه‌ای که بشر تاکنون تولید کرده است» توصیف کرد. این دستاورد حاصل بیش از ده سال تلاش علمی، حدود ۳ میلیارد دلار هزینه تحقیقاتی و رقابتی شدید میان کنسرسیوم دولتی پروژه ژنوم انسان و شرکت خصوصی سلرا ژنومیکس (Celera Genomics) به رهبری کریگ ونتر بود. در نهایت، این پروژه توانست توالی تقریبا کامل یک ژنوم انسانی را ارائه دهد. در همان زمان، تونی بلر نخست‌وزیر بریتانیا پیش‌بینی کرد که این نقشه ژنتیکی می‌تواند انقلابی در علم پزشکی ایجاد کند؛ انقلابی که پیامدهای آن حتی از کشف آنتی‌بیوتیک‌ها نیز فراتر خواهد رفت. هرچند درباره میزان تحقق این پیش‌بینی هنوز هم بحث وجود دارد، اما بدون تردید پیشرفت در روش‌های مختلف توالی یابی DNA نقش مهمی در تحول زیست‌شناسی و پزشکی مدرن داشته است. چند ماه پس از این اعلام تاریخی، دو گروه پژوهشی پروژه ژنوم انسان و شرکت Celera نتایج خود را به ترتیب در مجلات علمی Nature و Science منتشر کردند.

با این حال، تلاش برای تعیین توالی کامل ژنوم انسان از سال ۱۹۹۰ آغاز شد، در حالی که فناوری‌های مورد استفاده در این پروژه از سال‌ها قبل در حال توسعه بودند. در واقع، بسیاری از روش‌های مختلف توالی یابی DNA ریشه در پژوهش‌هایی دارند که از دهه ۱۹۴۰ در زمینه توالی‌یابی پروتئین‌ها و RNA انجام می‌شد. این تحقیقات اولیه پایه‌های علمی لازم را برای توسعه فناوری‌های دقیق‌تر در خواندن توالی‌های ژنتیکی فراهم کردند.

بیش از بیست سالی که از انتشار اولین پیش‌نویس ژنوم انسان می‌گذرد و هزینه توالی‌یابی به شکل چشمگیری کاهش یافته است. میانگین هزینه تعیین توالی یک ژنوم کامل تقریبا صد هزار برابر کمتر شده و امروزه به کمی بیش از ۵۰۰ دلار رسیده است. همچنین هزینه توالی یابی یک میلیون باز DNA که به آن «مگاباز» گفته می‌شود، به حدود شش دهم سنت کاهش پیدا کرده است. این کاهش چشمگیر قیمت تا حد زیادی نتیجه نوآوری‌های فناوری در حوزه توالی یابی DNA است. پیشرفت در شیمی واکنش‌های توالی یابی، توسعه روش‌های محاسباتی برای کنار هم قرار دادن خوانش‌های خام و تشکیل توالی‌های کامل ژنوم، و همچنین طراحی دستگاه‌های پیشرفته و کارآمد توالی یابی تجاری، همگی نقش مهمی در این تحول داشته‌اند. در طول چند دهه گذشته، دانشمندان روش‌های مختلف توالی یابی DNA متعددی را توسعه داده‌اند. با این حال، در میان همه این تکنیک‌ها، پنج روش از اهمیت ویژه‌ای برخوردارند و نقش تعیین‌کننده‌ای در پیشرفت فناوری‌های ژنومیک داشته‌اند. در ادامه مقاله، با این روش‌های مهم و تاریخچه شکل‌گیری آن‌ها بیشتر آشنا خواهیم شد.

روش توالی‌یابی سنگر (Sanger Sequencing)

فرد سنگر (Fred Sanger) یکی از بزرگ‌ترین رمزگشایان تاریخ زیست‌شناسی مولکولی به شمار می‌رود. این بیوشیمی‌دان بریتانیایی که تمام دوران علمی خود را در دانشگاه کمبریج گذراند، تنها فردی در تاریخ است که دو جایزه نوبل را در یک حوزه علمی دریافت کرده است. نخستین نوبل او در سال ۱۹۵۸ در رشته شیمی به دلیل ابداع روشی برای تعیین توالی اسیدهای آمینه در پروتئین‌ها (به‌ویژه انسولین) اعطا شد. سال‌ها بعد نیز او به خاطر توسعه روش‌هایی برای تعیین توالی DNA، در سال ۱۹۸۰ بار دیگر جایزه نوبل شیمی را دریافت کرد. دستاوردهای او نقش مهمی در شکل‌گیری و توسعه روش‌های مختلف توالی یابی DNA داشت.

پس از دریافت نخستین جایزه نوبل، سنگر توجه خود را به RNA معطوف کرد و تلاش کرد اولین فردی باشد که توالی کامل یک مولکول RNA را تعیین می‌کند. با این حال، در این رقابت از رابرت هالی، بیوشیمی‌دان دانشگاه کرنل، عقب ماند. هالی در سال ۱۹۶۵ موفق شد توالی کامل یک مولکول RNA انتقالی آلانین (tRNA) شامل ۷۷ نوکلئوتید را گزارش کند.

امروزه بسیاری از افراد تصور می‌کنند که سنگر اولین دانشمندی بود که روش تعیین توالی DNA را کشف کرد، اما واقعیت کمی متفاوت است. همانند ماجرای RNA، در این زمینه نیز دانشمند دیگری زودتر به نتیجه رسید. در سال ۱۹۷۰، ری وو (Ray Wu) از دانشگاه کرنل روشی را منتشر کرد که امکان خواندن بخش‌های خاصی از ژنوم دو ویروس باکتریایی به نام‌های λ و باکتریوفاژ ۱۸۶ را فراهم می‌کرد. با این حال، این روش تنها قادر به تعیین توالی بخش‌های کوتاه تک‌رشته‌ای موسوم به cohesive ends بود و به همین دلیل یک راهکار عمومی برای توالی‌یابی DNA محسوب نمی‌شد. در سال ۱۹۷۴ آزمایشگاه وو این روش را بهبود داد و اولین روش عمومی توالی‌یابی DNA را ارائه کرد، اما این روش بسیار زمان‌بر و پرزحمت بود و در عمل به طور گسترده مورد استفاده قرار نگرفت.

 

 

در سال ۱۹۷۵، فِرِد سنگر به همراه تکنسین آزمایشگاه خود، آلن کولسون (Alan Coulson)، روش جدیدی برای تعیین توالی DNA معرفی کرد که به «روش پلاس و ماینِس» (plus and minus technique) معروف شد. در این روش، رشته DNA مورد بررسی با آنزیم DNA پلی‌مراز، یک پرایمر، سه نوکلئوتید معمولی (dNTP) و یک نوکلئوتید نشاندار رادیواکتیو مخلوط می‌شد. نوکلئوتیدهای رادیواکتیو مانند نوکلئوتیدهای معمولی در رشته DNA در حال سنتز وارد می‌شدند، اما به دلیل داشتن ایزوتوپ‌های رادیواکتیو مانند فسفر-۳۲ یا گوگرد-۳۵ می‌توانستند با دستگاه‌های آشکارساز تابش شناسایی شوند. در این واکنش، غلظت نوکلئوتیدها پایین نگه داشته می‌شد و زمان انکوباسیون کوتاه بود، به طوری که سنتز DNA در نقاط تصادفی متوقف می‌شد و مجموعه‌ای از قطعات DNA با طول‌های مختلف ایجاد می‌کرد. این قطعات ناقص سپس خالص‌سازی شده و به عنوان الگو در هشت واکنش جداگانه شامل چهار واکنش «ماینِس» و چهار واکنش «پلاس» استفاده می‌شدند.

در واکنش‌های ماینِس، قطعات DNA در حضور سه نوع از چهار نوکلئوتید قرار می‌گرفتند. در نتیجه DNA پلی‌مراز رشته را تا جایی ادامه می‌داد که به نوکلئوتید حذف‌شده نیاز پیدا کند و در همان نقطه سنتز متوقف می‌شد. واکنش‌های پلاس مکانیزم متفاوتی داشتند. در این واکنش‌ها از آنزیم T4 DNA polymerase استفاده می‌شد که فعالیت اگزونوکلئازی قوی در جهت 3’ به 5’ دارد و می‌تواند انتهای رشته DNA را تجزیه کند. در حضور تنها یک نوع نوکلئوتید، این آنزیم رشته را از انتهای 3’ کوتاه می‌کرد تا زمانی که به باز مکمل آن نوکلئوتید برسد و در همان نقطه فعالیت تجزیه متوقف شود. به این ترتیب، تمام قطعات موجود در هر واکنش پلاس با یک نوکلئوتید مشخص به پایان می‌رسیدند.

 

 

از آنجا که این هشت واکنش روی قطعاتی با طول‌های تصادفی انجام می‌شدند، در مجموع مجموعه‌ای از قطعات DNA با تمام طول‌های ممکن تولید می‌شد. سپس این قطعات با استفاده از الکتروفورز ژل بر اساس اندازه از هم جدا می‌شدند و با روش اتورادیوگرافی مشاهده می‌شدند. در این روش، ژل خشک شده در تماس با فیلم اشعه ایکس قرار می‌گرفت و قطعات DNA رادیواکتیو به صورت باندهای تیره روی فیلم ظاهر می‌شدند. دانشمندان با بررسی دقیق این باندها می‌توانستند توالی DNA را به صورت دستی استخراج کنند.

 

 

 

 

در سال ۱۹۷۷، سنگر و همکارانش با استفاده از همین روش موفق شدند اولین ژنوم کامل DNA را تعیین توالی کنند. این ژنوم متعلق به یک ویروس باکتریایی کوچک به نام ɸX174 یا PhiX بود که ۵۳۸۶ نوکلئوتید طول داشت. در همان سال، سنگر روش بسیار ساده‌تر و کارآمدتری معرفی کرد که به «روش خاتمه زنجیره» (chain termination) معروف شد و امروزه معمولا با نام Sanger sequencing شناخته می‌شود. این روش از نوع خاصی از نوکلئوتیدها به نام دی‌دئوکسی‌ریبونوکلئوتید (ddNTP) استفاده می‌کرد. این مولکول‌ها فاقد یکی از گروه‌های هیدروکسیل موجود در نوکلئوتیدهای معمولی هستند و به همین دلیل پس از اضافه شدن به رشته DNA، امکان اتصال نوکلئوتید بعدی را از بین می‌برند و سنتز DNA را متوقف می‌کنند.

 

 

در واکنش توالی‌یابی سنگر، مخلوط واکنش شامل DNA الگو، یک پرایمر، آنزیم DNA پلی‌مراز و هر چهار نوکلئوتید معمولی بود. علاوه بر این، در هر واکنش مقدار کمی از یک ddNTP نشاندار رادیواکتیو مربوط به یکی از چهار باز نیز اضافه می‌شد. مقدار کم ddNTP باعث می‌شد که در نقاط مختلفی از توالی که آن باز وجود دارد، سنتز DNA متوقف شود و مجموعه‌ای از قطعات با طول‌های مختلف ایجاد شود. سپس با جداسازی این قطعات بر اساس اندازه و ثبت آن‌ها با اتورادیوگرافی، امکان خواندن توالی نهایی DNA فراهم می‌شد.

 

 

 

در همین دوره، روش دیگری برای توالی‌یابی DNA توسط آلن ماکسام (Allan Maxam) و والتر گیلبرت (Walter Gilbert) توسعه یافت که بر اساس برش شیمیایی DNA در بازهای خاص عمل می‌کرد. در این روش، نمونه‌های DNA نشاندار رادیواکتیو در چهار واکنش جداگانه قرار می‌گرفتند که هر کدام شامل ماده شیمیایی خاصی بودند که DNA را پس از بازهای مشخصی مانند A/G ، G ، C یا C/T می‌برید. با تنظیم مناسب غلظت مواد شیمیایی، قطعاتی ایجاد می‌شد که در هر باز خاص قطع شده بودند و سپس با الکتروفورز ژل و اتورادیوگرافی توالی خوانده می‌شد.

اگرچه روش ماکسام–گیلبرت در ابتدا نسبت به روش پلاس و ماینِس ساده‌تر بود، اما در نهایت روش خاتمه زنجیره سنگر به فناوری غالب تبدیل شد. بسیاری از زیست‌شناسان مولکولی این روش را از نظر فنی مناسب‌تر و از نظر مفهومی «ظریف‌تر» می‌دانستند، زیرا فرآیند آن شباهت زیادی به روند طبیعی همانندسازی DNA داشت.

با وجود دقت بالای روش سنگر و ساده‌تر بودن آن نسبت به روش‌های قبلی، این تکنیک همچنان به استفاده از مواد رادیواکتیو و خواندن دستی نتایج نیاز داشت. در سا ۱۹۸۶ آزمایشگاه لروی هود (Leroy Hood) در موسسه فناوری کلتک (Caltech) این مشکل را با جایگزینی ddNTPهای رادیواکتیو با نوکلئوتیدهای فلورسنت برطرف کرد. در این روش جدید، هر باز با یک رنگ فلورسنت متفاوت نشاندار می‌شد. به این ترتیب می‌شد محصولات هر چهار واکنش را در یک ژل واحد اجرا کرد و کامپیوتر با تشخیص رنگ سیگنال‌های فلورسنت هنگام عبور قطعات از مقابل یک لیزر، توالی DNA را به صورت خودکار تعیین کند.

در همان سال، اولین دستگاه تجاری توالی‌یابی سنگر توسط شرکت Applied Biosystems ساخته شد. این دستگاه که ABI 370A نام داشت با قیمت ۹۲٬۵۰۰ دلار عرضه شد. از آنجا که سنگر روش خود را ثبت اختراع نکرده بود، شرکت‌های دیگر نیز توانستند دستگاه‌های مشابهی تولید کنند و تا سال ۱۹۸۸ سه دستگاه مختلف توالی‌یابی سنگر در بازار وجود داشت. بعدها مدل‌های پیشرفته‌تری نیز معرفی شدند، از جمله دستگاه Perkin‑Elmer 3700 که در پروژه ژنوم انسان و شرکت Celera استفاده شد، و همچنین دستگاه ABS 3500 Genetic Analyzer که هنوز هم در بسیاری از آزمایشگاه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.

 

 

روش توالی‌یابی پایروسکوئنسینگ (454 Pyrosequencing)

در زمانی که توالی‌یابی سنگر به‌تدریج تجاری‌سازی می‌شد، پایه‌های یک شیمی جدید برای تعیین توالی DNA نیز در حال شکل‌گیری بود. در سال ۱۹۸۵ دو بیوشیمی‌دان سوئدی به نام‌های پال نیرن (Pål Nyren) و آرنه لوندین (Arne Lundin) روشی را معرفی کردند که می‌توانست غلظت مولکولی به نام پیروفسفات (PPi) را با استفاده از یک آبشار آنزیمی که نور تولید می‌کند اندازه‌گیری کند. مدت کوتاهی بعد، در اوایل سال ۱۹۸۶، نیرن متوجه شد که این روش می‌تواند برای تعیین توالی DNA نیز مورد استفاده قرار گیرد، زیرا مولکول پیروفسفات به طور طبیعی به عنوان محصول جانبی در فرآیند سنتز DNA تولید می‌شود.

با وجود این ایده مهم، محدودیت‌های مالی باعث شد نیرن در سال‌های اولیه نتواند زمان زیادی را به توسعه این روش اختصاص دهد. سرانجام در سال ۱۹۹۳ او توانست نخستین اثبات تجربی این فناوری را منتشر کند. در این روش، DNA الگو همراه با یک پرایمر، یک نوع نوکلئوتید (dNTP) و سه آنزیم در یک واکنش قرار می‌گرفتند: DNA پلی‌مراز، ATP سولفوریلاز و آنزیم لوسیفراز که در کرم شب‌تاب وجود دارد.

اگر نوکلئوتید اضافه‌شده با توالی DNA سازگار بود، در طی واکنش سنتز DNA مولکول پیروفسفات تولید می‌شد. سپس آنزیم ATP سولفوریلاز این پیروفسفات را به ATP تبدیل می‌کرد و ATP انرژی لازم برای فعالیت آنزیم لوسیفراز را فراهم می‌کرد. فعال شدن لوسیفراز باعث تولید نور می‌شد. بنابراین با اندازه‌گیری نور تولیدشده می‌توان تشخیص داد که آیا نوکلئوتید مورد نظر در رشته DNA اضافه شده است یا نه. در این روش نوکلئوتیدها به صورت تک‌به‌تک به واکنش اضافه می‌شدند و هر بار در صورت تولید نور، باز مربوطه در توالی ثبت می‌شد. سپس نوکلئوتیدهای اضافی شسته می‌شدند و چرخه دوباره تکرار می‌شد. به این ترتیب، توالی DNA بدون نیاز به ژل الکتروفورز و تنها با ثبت سیگنال‌های نوری تعیین می‌شد.

از آنجا که این روش بر اساس تولید پیروفسفات عمل می‌کرد، «پایروسکوئنسینگ» یا Pyrosequencing نام گرفت. در ابتدای توسعه این فناوری، امکان تعیین توالی تنها چند نوکلئوتید کوتاه وجود داشت. اما در سال ۱۹۹۶ آزمایشگاه نیرن توانست با استفاده از نسخه اصلاح‌شده‌ای از نوکلئوتید آدنین، طول توالی قابل خواندن را تا حدود ۱۵ باز افزایش دهد. دو سال بعد، در سال ۱۹۹۸، آن‌ها با افزودن آنزیمی به نام آپیراز (apyrase) این مقدار را به ۳۴ باز رساندند. آپیراز نوکلئوتیدهای استفاده‌نشده را تجزیه می‌کرد و به این ترتیب نیاز به شست‌وشوی مداوم واکنش در هر مرحله کاهش پیدا می‌کرد.

 

 

در همین دوره، آزمایشگاه نیرن شرکتی به نام Pyrosequencing AB تاسیس کرد تا این فناوری را توسعه داده و تجاری‌سازی کند. با این حال، شرکتی که در نهایت این فناوری را به بازار آورد، شرکت 454 Life Sciences در ایالت کنتیکت آمریکا بود. این شرکت در سال ۲۰۰۳ امتیاز استفاده از پایروسکوئنسینگ برای تعیین توالی کل ژنوم را دریافت کرد.

فناوری 454 با طراحی تراشه‌هایی که امکان انجام هزاران واکنش توالی‌یابی به صورت موازی را فراهم می‌کرد، تحول مهمی ایجاد کرد. در سال ۲۰۰۵ این شرکت دستگاه توالی‌یابی GS20 را با قیمت حدود ۵۰۰ هزار دلار معرفی کرد. در این سیستم، هر مولکول DNA ابتدا به یک bead بسیار کوچک متصل می‌شد و سپس با استفاده از واکنش PCR چندین نسخه از آن ساخته می‌شد. هر  bead در یک چاهک کوچک از یک میکروپلیت قرار می‌گرفت و واکنش توالی‌یابی در همان چاهک انجام می‌شد. نور تولیدشده در اثر فعالیت آنزیم لوسیفراز از کف چاهک‌ها قابل تشخیص بود و به این ترتیب توالی DNA ثبت می‌شد.

اگرچه پایروسکوئنسینگ دیرتر از آن توسعه یافت که در پروژه ژنوم انسان یا پروژه Celera مورد استفاده قرار گیرد، اما اهمیت زیادی در تاریخ روش‌های مختلف توالی یابی DNA دارد. این فناوری اولین روش غیر از توالی‌یابی سنگر بود که به طور تجاری وارد بازار شد و آغازگر نسل جدید فناوری‌های توالی‌یابی موسوم به Next Generation Sequencing یا NGS محسوب می‌شود.

یکی از ویژگی‌های مهم پایروسکوئنسینگ این بود که توالی‌یابی را به صورت بلادرنگ انجام می‌داد. با این حال، این روش در تشخیص دقیق نواحی‌ای که چند نوکلئوتید مشابه پشت سر هم تکرار می‌شدند دچار مشکل بود. علت این مسئله آن بود که شدت نور تولیدشده همیشه به طور دقیق متناسب با تعداد واکنش‌های تولید پیروفسفات افزایش پیدا نمی‌کرد.

 

 

در سال ۲۰۰۶، شرکت 454 با ژنتیک‌دان سوئدی اسوانته پابو (Svante Pääbo) همکاری کرد و توانست اولین یک میلیون جفت‌باز از ژنوم نئاندرتال را تعیین توالی کند. این پروژه در نهایت چهار سال بعد با کمک فناوری‌های دیگر از جمله توالی‌یابی Illumina تکمیل شد. با پیشرفت سریع فناوری‌های NGS مانند Illumina، پایروسکوئنسینگ به‌تدریج توان رقابت خود را از دست داد و در سال ۲۰۱۳ شرکت Roche که شش سال قبل شرکت 454 را خریداری کرده بود، فعالیت آن را متوقف کرد.

با وجود این، پایروسکوئنسینگ هنوز در برخی کاربردهای تخصصی مورد استفاده قرار می‌گیرد. مهم‌تر از همه، این فناوری اولین جایگزین تجاری موفق برای توالی‌یابی سنگر بود و نخستین روشی محسوب می‌شود که امکان خودکارسازی کامل فرآیند توالی‌یابی DNA را فراهم کرد، زیرا برخلاف روش‌های قدیمی به ژل الکتروفورز و مراحل دستی پیچیده وابسته نبود.

روش توالی‌یابی بر اساس سنتز (Sequencing by Synthesis)

روش‌های مختلف توالی یابی DNA طی چند دهه گذشته پیشرفت‌های چشمگیری داشته‌اند و یکی از مهم‌ترین آن‌ها روش «توالی‌یابی بر اساس سنتز» است. این فناوری که امروزه بیشتر با فناوری ایلومینا (Illumina) شناخته می‌شود، امکان تعیین توالی DNA را با دقت بالا و در مقیاس بسیار بزرگ فراهم کرده است. در این روش، توالی DNA با ساختن یک رشته مکمل و شناسایی مرحله‌به‌مرحله نوکلئوتیدهای افزوده‌شده تعیین می‌شود.

در اواسط دهه ۱۹۹۰، دو بیوشیمیست دانشگاه کمبریج به نام‌های دیوید کلنرمن (David Klenerman) و شانکار بالاسوبرامانیان (Shankar Balasubramanian) تلاش می‌کردند یک مسئله بنیادی را حل کنند: چگونه می‌توان فعالیت یک مولکول منفرد DNA پلی‌مراز را هنگام کار مشاهده کرد؟ آن‌ها در رویکرد خود از نوکلئوتیدهای تغییریافته‌ای استفاده کردند که «ترمیناتورهای برگشت‌پذیر» نامیده می‌شدند. این مولکول‌ها با چهار رنگ متفاوت از مولکول‌های فلورسنت نشاندار شده بودند.

زمانی که یکی از این ترمیناتورها توسط آنزیم DNA پلی‌مراز انتخاب و به رشته در حال تکثیر DNA اضافه می‌شد، اضافه شدن هر باز دیگر را تا زمانی که این ترمیناتور با یک واکنش شیمیایی جدا شود، متوقف می‌کرد. بینش مهم کلنرمن و بالاسوبرامانیان این بود که می‌توان DNA الگو را با سنتز رشته‌ای مکمل از این ترمیناتورهای برگشت‌پذیر توالی‌یابی کرد. به بیان ساده، رشته DNA مرحله‌به‌مرحله و هر بار با یک باز گسترش پیدا می‌کرد و هویت هر نوکلئوتید با مشاهده رنگ فلوروفور متصل به آن مشخص می‌شد. این دو پژوهشگر در سال ۱۹۹۸ شرکتی به نام Solexa تاسیس کردند تا این فناوری را توسعه دهند.

با این حال، تشخیص سیگنال فلورسنت از یک مولکول منفرد DNA در عمل بسیار دشوار بود. به همین دلیل، در سال ۲۰۰۴ شرکت Solexa حق مالکیت فکری روشی به نام «توالی‌یابی کلونی» (Colony Sequencing) را خریداری کرد. این روش توسط دانشمندان فرانسوی پاسکال مایر (Pascal Mayer) و لوران فارینلی (Laurent Farinelli) توسعه یافته بود و هدف آن حل مشکل تشخیص سیگنال بود.

در توالی‌یابی کلونی، قطعات DNA به سطحی متصل می‌شوند و بارها تکثیر می‌گردند تا «کلونی‌هایی» از تعداد بسیار زیادی رشته DNA یکسان ایجاد شود. با خواندن همزمان سیگنال فلورسنت از تمام رشته‌های موجود در یک کلونی، امکان تعیین باز اضافه‌شده در هر مرحله با دقت بسیار بیشتری فراهم می‌شود؛ زیرا خطاهای تصادفی موجود در رشته‌های منفرد در سیگنال اجماعی میانگین گرفته می‌شوند.

پس از آنکه تشخیص مولکول منفرد دیگر ضروری نبود، شرکت Solexa توانست شیمی توالی‌یابی اختصاصی خود را توسعه دهد. این فرآیند روی تراشه‌ای به نام «فلوسل» (Flow Cell) انجام می‌شود که سطح آن با مجموعه‌ای از توالی‌های کوتاه DNA پوشانده شده است.

در ابتدا DNA الگو به قطعات کوچکتر شکسته می‌شود. سپس توالی‌هایی به نام «آداپتور» به دو انتهای هر قطعه اضافه می‌گردد که با توالی‌های موجود روی سطح فلوسل مکمل هستند. این قطعات DNA روی فلوسل عبور داده می‌شوند و آداپتورها به نقاط مکمل خود روی سطح متصل می‌شوند. در ادامه پرایمرها اضافه می‌شوند و اولین مرحله تکثیر آغاز می‌گردد. در این مرحله توالی‌های کوتاه روی فلوسل گسترش پیدا می‌کنند و رشته‌هایی مکمل قطعات DNA الگو ایجاد می‌کنند. سپس رشته‌های الگو شسته شده و از محیط حذف می‌شوند. در نتیجه توالی‌های موجود در قطعات DNA الگو اکنون مستقیما به سطح فلوسل متصل شده‌اند.

در این مرحله، هر توالی متصل تنها یک نسخه دارد و سیگنال تولیدشده آن بسیار ضعیف است. برای حل این مشکل، از فرایندی به نام «تقویت پل‌مانند» یا Bridge Amplification استفاده می‌شود تا خوشه‌هایی از قطعات DNA یکسان ایجاد شود. در این فرآیند، آداپتور موجود در انتهای آزاد هر رشته DNA می‌تواند با یکی از توالی‌های کوتاه موجود روی سطح فلوسل جفت شود. در نتیجه رشته خم می‌شود و ساختاری شبیه پل ایجاد می‌کند. سپس یک مرحله دیگر از تکثیر انجام می‌شود و دو رشته مکمل ایجاد می‌شوند که هر دو به سطح فلوسل متصل هستند. این چرخه بارها تکرار می‌شود و خوشه‌هایی از هزاران نسخه یکسان از همان قطعه DNA شکل می‌گیرد.

 

 

پس از تشکیل خوشه‌ها، مرحله اصلی تعیین توالی آغاز می‌شود. در این مرحله، پرایمرها و ترمیناتورهای زنجیره‌ای نشاندار شده با فلورسنت به محیط واکنش اضافه می‌شوند. در نتیجه تنها یک نوکلئوتید به هر رشته DNA اضافه می‌شود. سپس از کل تراشه تصویربرداری انجام می‌شود تا رنگ فلورسنت هر خوشه ثبت گردد و نوع باز افزوده‌شده مشخص شود. پس از ثبت تصویر، گروه‌های مسدودکننده ترمیناتورها جدا می‌شوند تا امکان اضافه شدن نوکلئوتید بعدی فراهم شود. این چرخه بارها تکرار می‌شود تا واکنش کامل شود. نتیجه این فرآیند، توالی‌یابی همزمان تعداد بسیار زیادی قطعه DNA است که به آن توالی‌یابی موازی گسترده گفته می‌شود. خوانش‌های کوتاه به‌دست‌آمده از این فرایند می‌توانند با استفاده از تکنیکی محاسباتی به نام «تحلیل paired-end» به یکدیگر متصل شوند. در این روش با بررسی نواحی همپوشان بین خوانش‌ها، توالی کامل DNA بازسازی می‌شود.

اولین محصول شرکت Solexa با نام Genome Analyzer در سال ۲۰۰۶ و با قیمت حدود ۴۰۰ هزار دلار عرضه شد. یک سال بعد این شرکت توسط شرکت ژنومیک آمریکایی Illumina خریداری شد. در سال ۲۰۰۸ نیز مقاله‌ای منتشر شد که نشان می‌داد این فناوری قادر است ژنوم‌های کامل را با استفاده از خوانش‌های کوتاه به طور موثر توالی‌یابی کند. روش ایلومینا معمولا با عنوان «توالی‌یابی بر اساس سنتز» شناخته می‌شود. اگرچه از نظر فنی این اصطلاح می‌تواند برای روش‌های دیگری مانند روش سنگر نیز به کار رود، اما در عمل بیشتر برای اشاره به شیمی توالی‌یابی مورد استفاده در فناوری ایلومینا استفاده می‌شود.

از زمان معرفی Genome Analyzer، شرکت Illumina چندین دستگاه توالی‌یابی جدید برای کاربردها و محدوده‌های قیمتی مختلف توسعه داده است. خوانش‌های کوتاه در این روش از دقت بسیار بالایی برخوردارند و این فناوری نقش مهمی در کاهش هزینه‌های توالی‌یابی DNA داشته است.

 

 

در میان روش‌های مختلف توالی یابی DNA، فناوری ایلومینا به‌طور قابل توجهی رایج‌ترین روش در توالی‌یابی نسل جدید (NGS) محسوب می‌شود و در سال‌های اخیر حدود ۸۰ درصد سهم بازار را در اختیار داشته است. یکی از دلایل اصلی این موضوع، انعطاف‌پذیری بالای این فناوری در کاربردهای مختلف است.

از توالی‌یابی ایلومینا برای ایجاد ژنوم‌های مرجع جدید استفاده شده است؛ برای مثال ژنوم مرجع گوجه‌فرنگی با استفاده از این فناوری تعیین شده است. با این حال، این روش به‌ویژه در شرایطی بسیار مفید است که نیاز به توالی‌یابی مکرر قطعات کوتاه DNA وجود دارد. به عنوان نمونه، دستگاه‌های ایلومینا به طور گسترده برای اندازه‌گیری فعالیت ویرایشگرهای ژنومی مانند CRISPR استفاده می‌شوند. در چنین آزمایش‌هایی DNA الگو ممکن است ویرایش شده یا ویرایش نشده باشد و با خواندن مکرر ناحیه اطراف محل ویرایش، می‌توان درصد دقیق ویرایش ژنومی را تعیین کرد.

همچنین تعداد زیاد خوانش‌های کوتاه برای مطالعه DNA باستانی بسیار مفید است. نمونه‌های DNA استخراج‌شده از استخوان‌ها یا بقایای باستانی اغلب دارای قطعات تخریب‌شده هستند. در چنین شرایطی خوانش‌های کوتاه امکان بازسازی دقیق‌تر توالی را فراهم می‌کنند. برای مثال، از فناوری ایلومینا در پروژه ژنوم نئاندرتال استفاده شده است و همچنین برای توالی‌یابی بقایای انسان‌هایی با قدمت حدود ۱۰ هزار سال و بررسی الگوهای مهاجرت و تغییرات جمعیتی در دانمارک نوسنگی به کار رفته است.

روش توالی‌یابی PacBio SMRT

در میان روش‌های مختلف توالی‌یابی DNA، گروهی از پژوهشگران بر این باور بودند که به‌جای اتکا به خوانش‌های موازیِ تعداد زیادی از رشته‌های DNA (همان‌طور که در روش‌های ایلومینا انجام می‌شود) توالی‌یابی مولکول منفرد می‌تواند مسیر کارآمدتر و کم‌خطاتری باشد. روش‌های توالی‌یابی بر اساس سنتز به تکثیر مکرر نیاز دارند و این تکثیرهای پیاپی احتمال خطا را در هر مرحله افزایش می‌دهد و خروجی را به سمت توالی‌هایی سوق می‌دهد که DNA پلی‌مراز راحت‌تر تکثیر می‌کند. در مقابل، روش‌های تک‌مولکولی با هدف کاهش بایاس، حذف نیاز به تکثیر و کاهش هزینه‌ها معرفی شدند.

نخستین تلاش موفق در این مسیر در آزمایشگاه استیو کوئیک (Steve Quake) در کالتک (Caltech) توسعه یافت و توسط شرکت Helicos تجاری‌سازی شد، اما این فناوری پس از ورشکست شدن شرکت و مشکلات حقوقی، از بازار خارج شد. امروزه رایج‌ترین و شناخته‌شده‌ترین روش در این دسته، فناوری شرکت Pacific Biosciences یا PacBio است. این روش‌ها اغلب با عنوان «توالی‌یابی نسل سوم» شناخته می‌شوند، هرچند معمولا در کنار فناوری‌های نسل جدید مانند Illumina نیز دسته‌بندی می‌شوند.

PacBio در سال ۲۰۰۴ با هدف توسعه روشی جدید برای توالی‌یابی بر اساس پژوهش‌های وات وب (Watt Webb) و هارولد کرگ‌هد (Harold Craighead) در دانشگاه کرنل تاسیس شد. این دو پژوهشگر یک سال پیش از آن ساختاری به نام «راهبرهای موجِ با مُدِ صفر» (zero-mode waveguides) یا ZMW را توسعه داده بودند؛ محفظه‌های بسیار کوچکی که فقط برای قرار گرفتن یک DNA پلی‌مراز طراحی شده‌اند و در کف خود سوراخ‌هایی دارند که امکان تشخیص نور را فراهم می‌کنند. با اتصال DNA پلی‌مراز به کف این محفظه و استفاده از نوکلئوتیدهای فلورسنت (برای مثال نوکلئوتید C با رنگ مشخص)، امکان رصد لحظه‌ای اتصال هر باز فراهم شد. این نور فلورسنت از طریق سوراخ ZMW به میکروسکوپ منتقل می‌شد و قابل تشخیص بود.

در سال ۲۰۰۹ PacBio مقاله‌ای منتشر کرد که نشان می‌داد این اصل را می‌توان به یک روش کامل توالی‌یابی تبدیل کرد. در این روش نیز هر چهار نوکلئوتید با رنگ‌های متفاوت نشاندار می‌شدند تا هنگام اضافه شدن به رشته در حال رشد، قابل شناسایی باشند. فلوروفورها به گونه‌ای طراحی شده بودند که هنگام انجام واکنش شیمیایی و اتصال باز جدید از آن جدا شوند و از محفظه خارج گردند تا امکان تشخیص باز بعدی فراهم شود. این فرآیند روی تراشه‌هایی انجام می‌شد که حاوی تعداد زیادی چاهک بودند و هرچاهک یک مولکول منفرد DNA را در حال توالی‌یابی نگه می‌داشت؛ نوعی موازی‌سازی متفاوت که در آن هر چاهک نماینده یک مولکول مستقل بود.

در سال بعد PacBio روش جدیدی معرفی کرد که امکان خوانش چندباره یک مولکول واحد را فراهم می‌کرد. آن‌ها DNA دو رشته‌ای را به دو آداپتور تک‌رشته‌ای متصل کردند و ساختاری به نام «SMRTbell template» ساختند. توالی‌یابی از یک پرایمر روی یکی از آداپتورها آغاز می‌شد و سپس به دلیل حلقوی شدن مولکول، امکان حرکت چرخشی و توالی‌یابی چندباره همان مولکول وجود داشت. این فرایند که Rolling Circle Amplification نام گرفت، خطای ذاتی فناوری را به‌طور چشمگیری کاهش داد.

 

 

با تثبیت فناوری اصلی، PacBio در سال ۲۰۱۱ نخستین دستگاه خود با نام RS را عرضه کرد و پس از آن مدل‌های پیشرفته‌تری ساخت که چاهک‌های بیشتری در هر تراشه داشتند. نام رسمی این روش «توالی‌یابی تک‌مولکولی در زمان واقعی» یا SMRT است، اما اغلب با نام PacBio شناخته می‌شود. برخلاف ایلومینا که خوانش‌های کوتاه تولید می‌کند، PacBio در همان ابتدای معرفی، خوانش‌هایی با طول چند هزار باز تولید می‌کرد و امروزه این خوانش‌ها اغلب بالای ۱۰ هزار باز هستند.

 

 

توانایی تولید خوانش‌های بسیار طولانی باعث شده است PacBio مکمل ارزشمندی برای ایلومینا باشد. این فناوری به‌ویژه در خواندن ژنوم‌هایی کاربرد دارد که ساختار پیچیده‌تری دارند، از جمله ژنوم‌هایی که شامل نسخه‌های تکراری متعدد از یک ژن، نواحی طولانیِ تکراری، یا تغییرات ساختاری مانند حذف‌ها و درج‌های بزرگ هستند. این موارد معمولا در خوانش‌های کوتاه به‌خوبی شناسایی نمی‌شوند. برای مثال، PacBio برای توالی‌یابی باکتری بسیار دشواری به نام Clostridium autoethanogenum استفاده شد؛ باکتری‌ای که دارای تکرارهای فراوان، ۹ نسخه از یک ژن واحد و درج‌هایی از ژنوم ویروس‌های باکتریایی است؛ چیزی شبیه به نسخه ژنومی یک داستان پیچیده و دشوار.

روش توالی‌یابی نانوپور (Nanopore Sequencing)

در میان روش‌های مختلف توالی یابی DNA، فناوری نانوپور یکی از جدیدترین روش‌هایی است که به مرحله تجاری‌سازی رسیده است. این فناوری حاصل همکاری چندین گروه پژوهشی از دهه ۱۹۹۰ به بعد است و امروزه به عنوان یکی از مهم‌ترین روش‌های توالی‌یابی تک‌مولکولی شناخته می‌شود. در این روش، برخلاف برخی فناوری‌های دیگر، توالی DNA بدون نیاز به سنتز رشته مکمل خوانده می‌شود.

نانوپور در اصل یک پروتئین یا ساختار لیپیدی است که در مرکز خود یک حفره بسیار کوچک دارد و مولکول‌هایی مانند DNA می‌توانند از آن عبور کنند. نخستین نانوپوری که برای توالی‌یابی مورد استفاده قرار گرفت، پروتئینی به نام آلفا-همولیزین بود که یک سم پروتئینی تولیدشده توسط باکتری Staphylococcus aureus است. بعدها انواع دیگری از نانوپورهای زیستی و حتی نانوپورهای مصنوعی نیز مورد آزمایش قرار گرفتند.

در سال ۱۹۹۶، آزمایشگاه‌های دیوید دیمر در دانشگاه کالیفرنیا سانتا کروز و دنیل برانتون در دانشگاه هاروارد مقاله‌ای مشترک منتشر کردند که نشان می‌داد عبور بازهای DNA از داخل یک نانوپور می‌تواند جریان الکتریکی عبوری از آن را تغییر دهد. زمانی که جریان الکتریکی از یک نانوپور عبور می‌کرد، عبور بازهای پورینی (A و G) و پیریمیدینی (T و C) باعث اختلال‌هایی با شدت متفاوت در جریان می‌شد. اگرچه این روش در آن زمان هنوز قادر به تمایز میان هر چهار باز نبود، اما ایده کلی یک روش جدید توالی‌یابی تک‌مولکولی بر همین اساس شکل گرفت.

در سال ۲۰۰۱، آزمایشگاه هاگن بیلی (Hagan Bayley) در دانشگاه Texas A&M یک روش محدود توالی‌یابی را معرفی کرد. آن‌ها مشاهده کردند که جفت‌شدن صحیح یا نادرست بازهای DNA باعث ایجاد اختلال‌های متفاوتی در جریان الکتریکی نانوپور می‌شود. در این آزمایش، یک قطعه کوتاه DNA که چند باز ناشناخته داشت به ورودی نانوپور متصل شد. سپس رشته‌های کوتاه DNA دیگری که در موقعیت متناظر دارای بازهای متفاوت بودند به محیط اضافه شدند. با بررسی اینکه کدام باز باعث ایجاد اختلالی مطابق با جفت‌شدن کامل می‌شود، پژوهشگران می‌توانستند باز ناشناخته را حدس بزنند.

با این حال، برای آنکه بتوان رشته‌های DNA را مستقیما هنگام عبور از نانوپور بررسی کرد، دو مشکل اساسی باید حل می‌شد. نخست این که DNA با سرعت بسیار زیادی از نانوپور عبور می‌کرد و امکان تشخیص دقیق را از بین می‌برد. مشکل دوم این بود که در ابتدا تنها می‌شد پورین‌ها را از پیریمیدین‌ها تشخیص داد و تمایز میان هر چهار باز ممکن نبود.

در سال ۲۰۰۵، هاگن بیلی که در آن زمان به دانشگاه آکسفورد منتقل شده بود، در حل مشکل اول پیشرفت قابل توجهی ایجاد کرد. او با همکاری دانشمندانی از موسسه اسکریپس (Scripps) نشان داد که می‌توان با افزودن ساختارهای کوتاه «hairpin» به DNA، سرعت عبور آن از نانوپور را کاهش داد. این ساختارها تا حدی دهانه نانوپور را مسدود می‌کردند و در نتیجه حرکت DNA کندتر می‌شد. در همان سال، بیلی شرکت Oxford Nanopore Technologies (ONT) را برای توسعه این فناوری تاسیس کرد. این شرکت به سرعت فناوری‌های مختلفی را با یکدیگر ترکیب کرد و مجوزهای مالکیت فکری مربوط به پژوهش‌های آزمایشگاه‌های بیلی، دیمر (Deamer)، برانتون (Branton) و دیگران را دریافت کرد.

 

 

در سال ۲۰۱۰، ONT دو فناوری کلیدی را که هر یک یکی از مشکلات اصلی این روش را حل می‌کردند، با هم ترکیب کرد. نخست، یک نانوپور مهندسی‌شده بود که با همکاری آزمایشگاه بیلی توسعه یافته بود و می‌توانست بین بازهای مختلف DNA تمایز قائل شود. این پیشرفت مشکل تفکیک‌پذیری بازها را حل کرد. فناوری دوم روشی برای کاهش سرعت حرکت DNA بود که از آنزیم آشنای DNA پلی‌مراز استفاده می‌کرد. آزمایشگاه مارک اکسون در دانشگاه کالیفرنیا سانتا کروز پلی‌مراز خاصی از ویروس باکتریایی ɸ29 را شناسایی کرده بود که DNA را با سرعتی مناسب برای تشخیص در سیستم نانوپور تکثیر می‌کرد. در این روش، رشته‌های DNA الگو درست پیش از ورود به نانوپور تکثیر می‌شوند و با سرعتی کنترل‌شده از داخل حفره عبور می‌کنند. این سرعت پایین‌تر باعث می‌شود اثر هر باز بر جریان الکتریکی قابل اندازه‌گیری باشد و در نتیجه توالی DNA بتواند بازبه‌باز خوانده شود.

 

 

تا سال ۲۰۱۲ شرکت ONT نخستین داده‌های توالی‌یابی خود را منتشر کرد و فناوری نانوپور به سرعت به عنوان روشی سریع برای تولید خوانش‌های بسیار طولانی DNA شناخته شد. این روش بدون نیاز به سنتز DNA عمل می‌کند، اگرچه در نسخه‌های اولیه نرخ خطای آن نسبت به برخی روش‌های دیگر بیشتر بود. برای مثال در سال ۲۰۱۷ دقت خوانش‌های نانوپور حدود ۸۵ تا ۹۰ درصد برای هر باز گزارش شده بود، در حالی که دقت روش ایلومینا بیش از ۹۹ درصد بود. با این حال، پیشرفت‌های اخیر دقت این فناوری را در بسیاری از کاربردها به بیش از ۹۹ درصد رسانده است.

در سال ۲۰۱۵ شرکت Oxford Nanopore Technologies نخستین محصول تجاری خود را با نام MinION عرضه کرد. این دستگاه یک توالی‌یاب قابل حمل و کوچک بود که تنها حدود ۱۰۰۰ دلار قیمت داشت؛ رقمی که در مقایسه با بیشتر دستگاه‌های توالی‌یابی بسیار پایین محسوب می‌شد. در ادامه، این شرکت دستگاه‌های بزرگ‌تر و رومیزی مانند GridION و PromethION را نیز معرفی کرد.

جمع‌بندی

در آغاز، فرآیند تعیین توالی DNA کاری دشوار، زمان‌بر و حتی خطرناک بود؛ زیرا در روش‌های اولیه از مواد رادیواکتیو استفاده می‌شد. اما امروزه دستگاه‌های توالی‌یابی در سراسر جهان به طور گسترده مورد استفاده قرار می‌گیرند، ایمن‌تر هستند و به نیروی انسانی بسیار کمتری نیاز دارند. این تحول بزرگ تنها نتیجه پیشرفت در بیوشیمی نبود، بلکه حاصل ترکیب دستاوردهای بیوفیزیک، علم مواد و مهندسی ساخت تجهیزات پیشرفته بود که امکان تبدیل سامانه‌های آزمایشگاهی پیچیده به دستگاه‌هایی قابل تولید و عرضه در بازار را فراهم کرد.

در طول پنجاه سال گذشته روش‌های متعددی برای خواندن توالی DNA معرفی شده‌اند، اما پنج فناوری اصلی بیش از سایر روش‌ها تاثیرگذار بوده‌اند و مسیر پژوهش‌های ژنتیکی و پزشکی مدرن را شکل داده‌اند. این فناوری‌ها به پزشکان اجازه داده‌اند تا واریانت‌ها و جهش‌های ژنتیکی عامل بیماری را در بیماران شناسایی کنند. همچنین پژوهشگران توانسته‌اند با استفاده از آن‌ها اجتماعات میکروبی موجود در محیط‌هایی مانند آب دریا یا روده انسان را مطالعه کنند. علاوه بر این، تعیین توالی ژنوم نئاندرتال‌ها و انسان‌های باستانی امکان بررسی گذشته تکاملی انسان را فراهم کرده و دیدگاه‌های جدیدی درباره تاریخ زیستی ما ارائه داده است.

در عین حال، توسعه فناوری‌های توالی‌یابی همچنان ادامه دارد. برای مثال در سال ۲۰۲۵ شرکت Roche فناوری جدیدی به نام Sequencing by Expansion معرفی کرد. در این روش، مولکول‌های مهندسی‌شده‌ای به نام Xpandomers بین نوکلئوتیدها قرار می‌گیرند تا تشخیص آن‌ها در سامانه‌های نانوپور با دقت بیشتری انجام شود. همزمان، پژوهشگران و شرکت‌های فعال در این حوزه تلاش می‌کنند هزینه تعیین توالی DNA را باز هم کاهش دهند و آن را به سطحی بسیار پایین‌تر برسانند. برخی گروه‌ها هدف خود را خواندن کامل ژنوم انسان با هزینه‌ای حدود ۱۰۰ دلار یا کمتر قرار داده‌اند.

در این مسیر پیشرفت‌هایی نیز حاصل شده است. شرکت Ultima Genomics با معرفی دستگاه UG100 در سال ۲۰۲۲ که از سال ۲۰۲۴ عرضه شد، به چنین سطحی از هزینه نزدیک شد. همچنین شرکت Element Biosciences سامانه‌ای به نام VITARI را در فوریه ۲۰۲۶ معرفی کرد که قرار است در نیمه دوم همان سال عرضه شود و هزینه‌ای در همین محدوده داشته باشد. البته قیمت ۱۰۰ دلاری اعلام‌شده توسط این شرکت‌ها تنها شامل مواد مصرفی مورد استفاده در دستگاه است و هزینه‌هایی مانند نیروی انسانی، آماده‌سازی نمونه و تحلیل داده را دربر نمی‌گیرد.

با پیشرفت این فناوری‌ها، تقاضا برای داده‌های ژنومی نیز به سرعت افزایش یافته است. در سال‌های اخیر مطالعات گسترده‌ای مبتنی بر توالی‌یابی ژنوم کامل آغاز شده‌اند. برای نمونه می‌توان به مطالعه ELITE در دانشگاه استنفورد اشاره کرد که به دنبال شناسایی عوامل ژنتیکی موثر بر ظرفیت هوازی انسان است. همچنین برنامه All of Us که توسط موسسه ملی سلامت آمریکا اجرا می‌شود تاکنون بیش از ۲۰۰ هزار ژنوم انسانی را برای بررسی بیماری‌های ژنتیکی تعیین توالی کرده است.

نوآوری در فناوری‌های توالی‌یابی DNA بدون تردید ادامه خواهد داشت. با این حال، همین پنج فناوری اصلی طی نیم قرن گذشته کاری را که زمانی تقریبا غیرممکن به نظر می‌رسید به فرآیندی تبدیل کرده‌اند که امروزه می‌توان آن را تنها در یک شب انجام داد.