Batch effect چیست و چرا می‌تواند نتیجه آزمایش را غیرقابل اعتماد کند؟

در بسیاری از پژوهش‌های آزمایشگاهی، پژوهشگران تلاش می‌کنند شرایط آزمایش را تا جای ممکن ثابت نگه دارند. با این حال، حتی در شرایط کنترل‌شده نیز ممکن است عواملی وارد آزمایش شوند که نتیجه‌ها را تحت تاثیر قرار دهند. یکی از این عوامل مهم در پژوهش‌های زیستی و داده‌های آزمایشگاهی «Batch effect» است. در این مقاله به این موضوع می‌پردازیم که Batch effect چیست و چرا می‌تواند باعث ایجاد خطا در نتایج شود. به بیان ساده، Batch effect به تفاوت‌های ناخواسته‌ای گفته می‌شود که به دلیل انجام آزمایش در دسته‌ها یا زمان‌های مختلف ایجاد می‌شوند. این تفاوت‌ها معمولا به دلیل تغییرات جزئی در شرایط آزمایش، تجهیزات، مواد مصرفی یا حتی اپراتور آزمایشگاه به وجود می‌آیند. در نتیجه، بخشی از تفاوت مشاهده‌شده در داده‌ها ممکن است ناشی از شرایط آزمایش باشد، نه تفاوت واقعی بین نمونه‌ها. اگر این اثر شناسایی و کنترل نشود، می‌تواند باعث تفسیر نادرست داده‌ها شود. در برخی موارد حتی ممکن است پژوهشگر به این نتیجه برسد که بین دو گروه تفاوت زیستی وجود دارد، در حالی که این تفاوت در واقع ناشی از Batch effect است. جالب است بدانید بسیاری از مطالعات زیستی، از این موضوع رنج می‌برند و پژوهشگران، به دلیل عدم آگاهی یا عدم توجه به این موضوع، تفسیرهای نادرستی را از نتایج به دست آمده می‌کنند. بنابراین، درک چگونگی ایجاد و مواجه با آن، موضوع بسیار مهمی است.

Batch effect چیست و چرا در آزمایش‌ها رخ می‌دهد؟

در این بخش، قصد داریم به شکل جزئی‌تری به بررسی این مفهوم بپردازیم. برای پاسخ به این پرسش که Batch effect چیست، ابتدا باید مفهوم «batch» در آزمایش‌های علمی را درک کنیم. در بسیاری از آزمایش‌ها، همه نمونه‌ها به طور هم‌زمان بررسی نمی‌شوند. به دلیل محدودیت زمان، ظرفیت دستگاه‌ها یا هزینه‌ها، نمونه‌ها در چند گروه یا «دسته» جداگانه آزمایش می‌شوند. هر یک از این دسته‌ها یک batch محسوب می‌شود.

Batch effect به تفاوت‌های سیستماتیکی گفته می‌شود که بین این دسته‌های مختلف ایجاد می‌شود، اما منشا آن‌ها زیستی نیست. به بیان دیگر، این تفاوت‌ها به دلیل شرایط اجرای آزمایش به وجود می‌آیند، نه به دلیل تفاوت واقعی میان نمونه‌ها. بنابراین ممکن است داده‌ها الگوهایی نشان دهند که در واقع حاصل شرایط آزمایش هستند. عوامل مختلفی می‌توانند باعث ایجاد Batch effect شوند. حتی تغییرات کوچک در محیط یا ابزار آزمایشگاهی ممکن است چنین اثری ایجاد کند. برای مثال:

• انجام آزمایش در روزهای مختلف
• استفاده از سری‌های متفاوت مواد شیمیایی یا کیت‌های آزمایشگاهی
• تغییر در کالیبراسیون دستگاه‌ها
• تفاوت در دما، رطوبت یا شرایط محیطی آزمایشگاه
• انجام آزمایش توسط افراد مختلف

هر یک از این عوامل می‌تواند باعث شود داده‌های یک batch کمی متفاوت از batch دیگر باشند. این تفاوت‌ها معمولا کوچک هستند، اما در برخی آزمایش‌ها می‌توانند به اندازه‌ای باشند که الگوهای واقعی داده‌ها را پنهان کنند یا حتی نتایج گمراه‌کننده ایجاد کنند. به همین دلیل، در بسیاری از حوزه‌های پژوهشی مانند ژنومیکس، ترانسکریپتومیکس، پروتئومیکس و تحلیل داده‌های زیستی، بررسی و کنترل Batch effect بخشی مهم از طراحی آزمایش و تحلیل داده‌ها محسوب می‌شود.

چرا Batch effect می‌تواند نتیجه آزمایش را غیرقابل اعتماد کند؟

حال که مشخص شد Batch effect چیست، باید دید چرا این پدیده می‌تواند به مشکل جدی در تحلیل داده‌ها تبدیل شود. مسئله اصلی این است که Batch effect می‌تواند تفاوت‌های مصنوعی در داده‌ها ایجاد کند. این تفاوت‌ها ممکن است شبیه تفاوت‌های واقعی زیستی به نظر برسند، در حالی که در واقع ناشی از شرایط اجرای آزمایش هستند. در پژوهش‌های علمی، هدف این است که تفاوت‌های واقعی میان گروه‌ها شناسایی شود.

برای مثال، ممکن است پژوهشگر بخواهد تفاوت بیان ژن بین بیماران و افراد سالم را بررسی کند. فرض کنید ۲۰ نمونه از بیماران و ۲۰ نمونه از افراد سالم در اختیار دارد. به دلیل محدودیت ظرفیت دستگاه، آزمایش در دو روز انجام می‌شود. در روز اول بیشتر نمونه‌های بیماران بررسی می‌شوند و در روز دوم بیشتر نمونه‌های افراد سالم. حال تصور کنید در روز دوم شرایط آزمایش کمی متفاوت باشد. برای مثال ممکن است دستگاه اندازه‌گیری کمی متفاوت عمل کند، یک سری جدید از مواد آزمایشگاهی استفاده شود، یا دمای محیط کمی تغییر کرده باشد. چنین تفاوت‌های کوچکی ممکن است باعث شوند مقادیر اندازه‌گیری‌شده در روز دوم به طور میانگین کمی بالاتر یا پایین‌تر از روز اول ثبت شوند.

در این حالت، وقتی پژوهشگر داده‌ها را تحلیل می‌کند ممکن است ببیند که بیان ژن در گروه بیماران و افراد سالم متفاوت است. اما این اختلاف لزوما به دلیل تفاوت زیستی بین دو گروه نیست. در واقع بخشی از این تفاوت می‌تواند ناشی از این باشد که نمونه‌های دو گروه در batchهای مختلف آزمایش شده‌اند. در چنین شرایطی، Batch effect می‌تواند باعث دو نوع خطای مهم شود:

• مشاهده تفاوتی که در واقع وجود ندارد. در این حالت داده‌ها نشان می‌دهند که بین بیماران و افراد سالم اختلاف وجود دارد، در حالی که این اختلاف ناشی از شرایط متفاوت آزمایش در batchهای مختلف است.
• پنهان شدن تفاوت واقعی بین گروه‌ها. اگر شرایط دو batch به گونه‌ای باشد که اثر آن‌ها جهت مخالف تفاوت واقعی زیستی باشد، ممکن است اختلاف واقعی میان بیماران و افراد سالم در داده‌ها کمتر دیده شود یا حتی کاملا پنهان بماند.

به همین دلیل، Batch effect می‌تواند تفسیر داده‌ها را به شدت تحت تاثیر قرار دهد. اگر پژوهشگر به وجود این اثر توجه نکند، ممکن است نتیجه بگیرد که یک ژن با بیماری مرتبط است یا برعکس، هیچ ارتباطی وجود ندارد، در حالی که این نتیجه بیشتر بازتاب شرایط انجام آزمایش است تا تفاوت واقعی زیستی.

Batch effect در چه نوع آزمایش‌هایی بیشتر دیده می‌شود؟

Batch effect می‌تواند در بسیاری از آزمایش‌های علمی رخ دهد، اما در برخی آزمایش‌ها بیشتر مشاهده می‌شود. این مسئله به ویژه در آزمایش‌هایی اهمیت دارد که تعداد زیادی نمونه بررسی می‌شود یا اندازه‌گیری‌ها با دستگاه‌های حساس انجام می‌گیرد. یکی از مهم‌ترین حوزه‌ها، آزمایش‌های زیست‌شناسی ‌مولکولی با داده‌های حجیم است. در این نوع مطالعات معمولا صدها یا حتی هزاران متغیر به طور هم‌زمان اندازه‌گیری می‌شوند (مثلا بیان هزاران ژن). در چنین شرایطی، حتی تغییرات کوچک در شرایط آزمایش می‌تواند باعث ایجاد الگوهای قابل توجه در داده‌ها شود. چند مثال از آزمایش‌هایی که Batch effect در آن‌ها زیاد گزارش شده است عبارت‌اند از:

• آزمایش‌های بررسی بیان ژن مانند RNA sequencing و microarray.
• مطالعات پروتئومیکس که در آن‌ها مقدار بسیاری از پروتئین‌ها اندازه‌گیری می‌شود.
• مطالعات متابولومیکس که ترکیبات شیمیایی کوچک در سلول یا بافت را بررسی می‌کنند.
• آزمایش‌های بزرگ غربالگری زیستی که در آن‌ها تعداد زیادی نمونه یا ترکیب آزمایش می‌شود.

در این نوع مطالعات معمولا داده‌ها در چندین مرحله یا در چند نوبت مختلف تولید می‌شوند. برای مثال ممکن است بخشی از نمونه‌ها در یک روز و بخش دیگر در روزهای بعدی پردازش شوند. همچنین ممکن است از چند دستگاه یا چند سری از مواد آزمایشگاهی استفاده شود. وقتی تعداد متغیرهای اندازه‌گیری‌شده زیاد است، اثرهای کوچک ناشی از batch می‌توانند در تحلیل‌های آماری بزرگ‌تر به نظر برسند. به همین دلیل، در این حوزه‌ها بررسی وجود Batch effect به یک مرحله استاندارد در تحلیل داده تبدیل شده است.

چگونه می‌توان Batch effect را کاهش داد یا کنترل کرد؟

Batch effect همیشه به طور کامل قابل حذف نیست، اما می‌توان با طراحی مناسب آزمایش و استفاده از روش‌های تحلیلی، اثر آن را تا حد زیادی کاهش داد. پژوهشگران معمولا از ترکیبی از روش‌های طراحی آزمایش و روش‌های آماری برای کنترل این مسئله استفاده می‌کنند.

طراحی مناسب آزمایش

یکی از مهم‌ترین راه‌ها برای کاهش Batch effect، توجه به آن در مرحله طراحی آزمایش است. اگر از ابتدا احتمال وجود این اثر در نظر گرفته شود، می‌توان ساختار آزمایش را به گونه‌ای تنظیم کرد که تاثیر آن کمتر شود. برای مثال، بهتر است نمونه‌های گروه‌های مختلف به طور یکنواخت در batchهای مختلف توزیع شوند. در این حالت، اگر تفاوتی بین batchها وجود داشته باشد، این تفاوت به طور مشابه بر همه گروه‌ها اثر می‌گذارد و کمتر باعث ایجاد خطا در مقایسه‌ها می‌شود.

تصادفی‌سازی نمونه‌ها

تصادفی‌سازی یکی از روش‌های رایج در طراحی آزمایش است. در این روش، ترتیب پردازش یا آزمایش نمونه‌ها به صورت تصادفی تعیین می‌شود. این کار باعث می‌شود که نمونه‌های مربوط به گروه‌های مختلف در batchهای مختلف به طور مخلوط قرار بگیرند. برای مثال، به جای آنکه همه نمونه‌های بیماران در یک روز و همه نمونه‌های افراد سالم در روز دیگری آزمایش شوند، نمونه‌ها به صورت تصادفی بین روزهای مختلف توزیع می‌شوند. این کار احتمال آن را کاهش می‌دهد که تفاوت بین batchها با تفاوت بین گروه‌ها اشتباه گرفته شود.

استفاده از روش‌های آماری اصلاح Batch effect

حتی با طراحی مناسب آزمایش، ممکن است مقداری Batch effect در داده‌ها باقی بماند. به همین دلیل در مرحله تحلیل داده نیز روش‌هایی برای شناسایی و اصلاح این اثر استفاده می‌شود. در برخی روش‌های آماری، اطلاعات مربوط به batch در مدل تحلیلی وارد می‌شود تا اثر آن از داده‌ها جدا شود. برای مثال در آزمایش‌های بررسی بیان ژن مانند microarray، داده‌های حاصل از نمونه‌هایی که در batchهای مختلف پردازش شده‌اند ممکن است الگوهای متفاوتی نشان دهند. یکی از روش‌های شناخته‌شده برای اصلاح این مشکل، استفاده از روش ComBat است که در پکیج SVA در R ارائه شده است.

جمع‌بندی

Batch effect یکی از چالش‌های مهم در بسیاری از آزمایش‌های زیست‌شناسی ‌مولکولی و داده‌های با حجم بالا است. با توجه به نکاتی که اشاره شد، امیدواریم که اهمیت توجه به این موضوع را درک کرده باشید و سعی کنید با توجه به نوع آزمایش خود، روش‌های شناسایی و از بین بردن Batch effect را مطالعه نمایید تا از مشکلات بعدی در آنالیز و تفسیر نتایج، پیشگیری شود.