Data normalization در داده‌های بیولوژیکی چیست و چه انواعی دارد؟

اگر تاکنون یک بار با داده‌های زیستی کار کرده باشید، احتمالا نام فرآیندی مرسوم به نام Data normalization را شنیده‌اید. مرحله‌ای مهم که بسیاری از افراد آن را انجام می‌دهند، اما از ماهیت و تاثیری که بر داده‌ها می‌گذارد، آگاهی کامل ندارند. عدم انجام این مرحله از آماده‌سازی داده‌های زیستی پیش از شروع آنالیزهای اصلی، بر کیفیت نتیجه اثر قابل توجهی دارد. با توجه به انواع روش‌های موجود برای نرمال‌سازی داده‌ها بسته به جنس داده‌ زیستی که با آن سروکار داریم، درک ماهیت این روش‌ها و تاثیری که بر روند آنالیز می‌گذارند، می‌تواند به انجام یک کار تحلیلی بهتر و شفاف‌تر کمک زیادی کند. در این مقاله، بعد از پاسخ به اینکه Data normalization چیست، به بررسی انواع روش‌های آن می‌پردازیم و سعی می‌کنیم اکثر روش‌های نرمال‌سازی ابداع شده مرتبط با داده‌های زیستی را در بهترین گروه‌بندی قرار دهیم.

Data normalization چیست؟

به بیان ساده، Data normalization فرآیندی است که در آن داده‌ها طوری تنظیم می‌شوند که بتوان نمونه‌های مختلف را به شکل منصفانه با هم مقایسه کرد. در آمار و علم داده، یکی از معانی رایج نرمال‌سازی این است که متغیرها را هم‌مقیاس کنیم. به بیان ساده، وقتی متغیرهای مختلف در مقیاس‌های بسیار متفاوت اندازه‌گیری شده باشند، normalization آن‌ها را به یک مقیاس مشترک تبدیل می‌کنند. برای مثال ممکن است یک متغیر در بازه ۰ تا ۱ باشد و متغیر دیگر در بازه ۰ تا ۱۰٬۰۰۰. در چنین شرایطی، برای اینکه بتوان این متغیرها را به شکل منصفانه مقایسه یا در یک مدل آماری استفاده کرد، آن‌ها را نرمال‌سازی می‌کنند. بنابراین، به معنی کلاسیک آماری، نرمال‌سازی داده‌ها یعنی آوردن مقیاس‌شان در یک بازه مشترک و قابل مقایسه.

در داده‌های بیولوژیکی نیز از مفهوم نرمالیزیشن استفاده می‌شود، اما در بعضی شرایط هدف آن کمی متفاوت است. علاوه بر یکسان‌سازی مقیاس، در بیولوژی Data normalization معمولا به مجموعه روش‌هایی گفته می‌شود که داده‌های آزمایشگاهی را اصلاح می‌کنند تا اثر عوامل فنی کاهش پیدا کند. به این ترتیب، داده‌های به‌دست‌آمده از نمونه‌های مختلف قابل مقایسه‌تر می‌شوند و تحلیل زیستی دقیق‌تر انجام می‌شود. به بیان ساده، یعنی داده‌های خام آزمایشگاهی را طوری تنظیم کنیم که تفاوت‌های مشاهده‌شده بیشتر ناشی از تفاوت‌های واقعی زیستی باشند، نه نتیجه تفاوت در شرایط آزمایش یا روش اندازه‌گیری.

در بسیاری از آزمایش‌های زیستی، هدف این است که داده‌های به‌دست‌آمده از چندین گروه نمونه با یکدیگر مقایسه شوند. برای مثال ممکن است پژوهشگر بخواهد بداند بیان یک ژن در سلول سالم و سلول بیمار چه تفاوتی دارد، یا میزان یک پروتئین در چند بافت مختلف چگونه تغییر می‌کند. در نگاه اول به نظر می‌رسد کافی است مقادیر اندازه‌گیری‌شده در هر گروه را مستقیما با هم مقایسه کنیم. اما در عمل چنین مقایسه‌ای معمولا قابل اعتماد نیست، زیرا داده‌های خام آزمایشگاهی تحت تاثیر عوامل مختلفی قرار می‌گیرند که لزوما به پدیده زیستی مورد مطالعه مربوط نیستند. اگر این نوع اختلاف‌ها اصلاح نشوند، تحلیل داده می‌تواند به نتیجه‌های نادرست منجر شود. پژوهشگر ممکن است تصور کند یک ژن به طور قابل توجهی بیشتر بیان شده است، در حالی که این تفاوت فقط به دلیل اختلاف در شرایط اندازه‌گیری بوده است. به همین دلیل پیش از انجام بسیاری از تحلیل‌های زیستی، لازم است داده‌های خام به شکلی تنظیم و آماده شوند که اثر این عوامل فنی تا حد امکان کاهش پیدا کند. اینجاست که Data normalization اهمیت پیدا می‌کند. در فرایند نرمال‌سازی، داده‌ها به گونه‌ای تبدیل می‌شوند که مقایسه بین نمونه‌ها منصفانه‌تر و قابل اعتمادتر شود.

چرا داده‌های بیولوژیکی به نرمالیزیشن نیاز دارند؟

داده های بیولوژیکی معمولا در قالب مجموعه بزرگی از اندازه گیری ها تولید می شوند. برای مثال در یک آزمایش بیان ژن ممکن است مقدار بیان هزاران ژن در چند نمونه مختلف اندازه گیری شود. هدف پژوهشگر معمولا این است که این نمونه ها را با هم مقایسه کند و ببیند کدام ژن ها یا مولکول ها در شرایط مختلف تغییر کرده اند. با این حال داده های خامی که مستقیما از آزمایش به دست می آیند همیشه برای چنین مقایسه ای مناسب نیستند.

دلیل اصلی این موضوع این است که بخشی از تفاوت های موجود در داده ها به زیست شناسی سیستم مربوط نمی شود. در عوض این تفاوت ها می توانند ناشی از نحوه جمع آوری داده، مقدار ماده اولیه یا ویژگی های فنی ابزارهای اندازه گیری باشند. اگر این عوامل اصلاح نشوند، ممکن است اختلاف هایی در داده دیده شود که در واقع بازتاب تفاوت های واقعی زیستی نیستند. نرمالیزیشن تلاشی است برای کاهش این اثرات و تبدیل داده‌ها به شکلی که مقایسه بین نمونه‌ها از نظر آماری منصفانه‌تر و قابل اعتمادتر باشد.

تفاوت در مقدار کل داده در هر نمونه

در بسیاری از آزمایش ها مقدار کل داده تولید شده در نمونه ها یکسان نیست. برای مثال در آزمایش RNA‑seq ممکن است در یک نمونه تعداد خوانش های بیشتری ثبت شود و در نمونه دیگر کمتر. در چنین شرایطی مقدار بیان بسیاری از ژن ها در نمونه اول بزرگ تر به نظر می رسد، حتی اگر از نظر زیستی تفاوت مهمی وجود نداشته باشد. نرمالیزیشن با در نظر گرفتن این تفاوت در مقدار کل داده کمک می کند مقادیر بین نمونه ها قابل مقایسه شوند.

سوگیری های فنی در فرآیند اندازه گیری

فرآیندهای آزمایشگاهی همیشه با مقداری خطای فنی همراه هستند. کارایی استخراج RNA، کیفیت آماده سازی کتابخانه یا حساسیت دستگاه اندازه گیری می تواند بین آزمایش ها متفاوت باشد. این تفاوت ها باعث می شوند برخی مقادیر در داده ها به طور سیستماتیک بزرگ‌تر یا کوچک‌تر ثبت شوند. هدف بسیاری از روش های نرمالیزیشن این است که چنین سوگیری های فنی را کاهش دهند تا داده‌ها تصویر دقیق تری از وضعیت زیستی ارائه دهند.

تفاوت در توزیع مقادیر داده

در برخی موارد مشکل فقط مربوط به مقدار کل داده نیست، بلکه شکل توزیع مقادیر نیز بین نمونه ها متفاوت است. برای مثال ممکن است در یک نمونه تعداد کمی ژن با بیان بسیار بالا وجود داشته باشد که مقیاس کل داده را تغییر دهد. در چنین شرایطی مقایسه مستقیم داده های خام می تواند گمراه کننده باشد. برخی روش های نرمالیزیشن تلاش می کنند توزیع داده ها را بین نمونه ها قابل مقایسه تر کنند تا تحلیل آماری بعدی دقیق تر انجام شود.

روش های رایج Data normalization در داده های بیولوژیکی

روش های مختلفی برای نرمال سازی داده‌های بیولوژیکی وجود دارد و انتخاب روش مناسب به نوع داده و نوع آزمایش بستگی دارد. برای مثال روش هایی که در داده های RNA‑seq استفاده می شوند ممکن است با روش های مورد استفاده در داده های میکروآرایه یا برخی داده های پروتئومیکس متفاوت باشند. اما می‌توانیم برای درک انواع روش‌های نرمال‌سازی، آن‌ها را در چند گروه کلی قرار دهیم. در ادامه با چند نمونه از روش های رایج نرمال سازی آشنا می شویم.

۱) Global Scaling

یکی از ساده‌ترین روش‌های Data normalization این است که داده‌های هر نمونه بر اساس مقدار کل داده تولیدشده در همان نمونه تنظیم شوند. ایده این روش بسیار ساده است. گاهی در یک آزمایش، مقدار کل داده‌ای که از هر نمونه به دست می‌آید با هم برابر نیست. در نتیجه اگر داده‌ها را به صورت خام مقایسه کنیم، ممکن است بعضی نمونه‌ها بزرگ‌تر به نظر برسند فقط به این دلیل که میزان داده بیشتری تولید کرده‌اند. برای روشن شدن موضوع یک مثال ساده را در نظر بگیرید. فرض کنید در یک آزمایش RNA‑seq مقدار بیان یک ژن در دو نمونه اندازه‌گیری شده است.

• در نمونه اول کل خوانش‌های ثبت شده: ۱۰ میلیون
• در نمونه دوم کل خوانش‌های ثبت شده: ۲۰ میلیون

اگر یک ژن در نمونه اول ۱۰۰۰ خوانش و در نمونه دوم ۲۰۰۰ خوانش داشته باشد، در نگاه اول ممکن است تصور کنیم بیان این ژن در نمونه دوم دو برابر شده است. اما در واقع میزان کل داده در نمونه دوم نیز دو برابر بوده است. بنابراین این تفاوت لزوماً به معنی تغییر واقعی در بیان ژن نیست.

در این روش ابتدا مجموع کل خوانش‌ها در هر نمونه در نظر گرفته می‌شود. سپس مقدار هر ژن نسبت به این مقدار کل تنظیم می‌شود. به زبان ساده، به جای استفاده از تعداد خام خوانش‌ها، از سهم هر ژن از کل داده نمونه استفاده می‌کنیم. این کار باعث می‌شود نمونه‌ها در یک مقیاس مشابه قرار بگیرند و مقایسه آن‌ها منطقی‌تر شود. در این گروه چند روش رایج وجود دارد که بیشتر در داده‌های RNA‑seq و داده‌های شمارشی استفاده می‌شوند. روش‌هایی مانند:

• CPM (Counts Per Million)
• RPKM (Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)
• FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped fragments)
• TPM (Transcripts Per Million)

در برخی از این روش‌ها، علاوه بر تعداد کل خوانش‌های هر نمونه، طول ژن نیز در محاسبه در نظر گرفته می‌شود تا امکان مقایسه دقیق‌تر بین ژن‌های مختلف فراهم شود.

روش‌های Global Scaling معمولا اولین مرحله در آماده‌سازی داده‌های زیستی هستند. این روش‌ها یک اصلاح پایه انجام می‌دهند و اختلاف‌های بزرگ ناشی از مقدار کل داده در هر نمونه را کاهش می‌دهند. با این حال در بسیاری از تحلیل‌های پیشرفته، این مرحله به تنهایی کافی نیست و ممکن است در ادامه از روش‌های پیچیده‌تر نرمالیزیشن نیز استفاده شود.

۲) روش‌های Robust یا Reference‑Based

در بسیاری از داده‌های زیستی، استفاده از روش‌های ساده‌ای مانند Global Scaling برای نرمال‌سازی همیشه کافی نیست. دلیل این موضوع این است که در برخی آزمایش‌ها ممکن است تعداد زیادی از ژن‌ها یا مولکول‌ها واقعا تغییر کرده باشند. در چنین شرایطی اگر مقیاس نمونه‌ها فقط بر اساس مجموع کل داده تنظیم شود، این تغییرات گسترده می‌توانند بر فرآیند نرمال‌سازی اثر بگذارند و باعث ایجاد سوگیری در نتایج شوند. به همین دلیل خانواده‌ای از روش‌های Data normalization توسعه یافته‌اند که تلاش می‌کنند در برابر این نوع تغییرات مقاوم‌تر باشند.

ایده اصلی در این روش‌ها این است که مقیاس نمونه‌ها با استفاده از اطلاعاتی تخمین زده شود که نسبتا پایدار هستند و کمتر تحت تاثیر مقادیر بسیار بزرگ یا تغییرات شدید قرار می‌گیرند. به بیان ساده، به جای آن‌که کل داده‌ها مستقیما برای تنظیم مقیاس استفاده شوند، از یک مرجع برای مقایسه نمونه‌ها استفاده می‌شود. این مرجع می‌تواند یک ژن مشخص، مجموعه‌ای از ژن‌ها، یا حتی یک مرجع آماری باشد که از خود داده‌ها ساخته می‌شود.

یکی از ساده‌ترین شکل‌های این رویکرد در Data normalization استفاده از ژن‌های مرجع است. این ژن‌ها معمولا در بیشتر سلول‌ها و بافت‌ها بیان می‌شوند و نقش آن‌ها در فرآیندهای پایه‌ای سلول است، مانند تولید انرژی یا حفظ ساختار سلول. به همین دلیل در بسیاری از شرایط زیستی انتظار می‌رود میزان بیان آن‌ها نسبتا پایدار باقی بماند. در این روش نرمالیزیشن فرض می‌شود که مقدار بیان ژن‌های مرجع بین نمونه‌های مختلف تغییر زیادی نمی‌کند. بنابراین می‌توان از آن‌ها به عنوان یک نقطه مرجع برای تنظیم سایر داده‌ها استفاده کرد. به بیان ساده، مقدار بیان ژن‌های مورد مطالعه نسبت به مقدار بیان ژن مرجع سنجیده می‌شود. این کار کمک می‌کند اختلاف‌هایی که به دلیل تفاوت در مقدار RNA اولیه، کیفیت نمونه یا شرایط آزمایش ایجاد شده‌اند تا حدی اصلاح شوند.

برای مثال فرض کنید در یک آزمایش بیان ژن، مقدار بیان یک ژن خاص در دو نمونه اندازه‌گیری شده است. اگر مقدار RNA اولیه در یکی از نمونه‌ها بیشتر بوده باشد، ممکن است مقدار بیان بسیاری از ژن‌ها در آن نمونه بزرگ‌تر ثبت شود. اما اگر مقدار بیان همان ژن را نسبت به یک ژن مرجع ثابت محاسبه کنیم، این اثر تا حدی کاهش پیدا می‌کند و مقایسه بین نمونه‌ها دقیق‌تر می‌شود. این روش به‌ویژه در آزمایش‌هایی مانند qPCR بسیار رایج است. در چنین آزمایش‌هایی معمولا یک یا چند ژن مرجع انتخاب می‌شود و مقدار بیان سایر ژن‌ها نسبت به آن‌ها محاسبه می‌شود. برخی از ژن‌هایی که در بسیاری از مطالعات به عنوان ژن مرجع استفاده شده‌اند عبارت‌اند از:

• ACTB
• GAPDH
• 18s rRNA

در کنار استفاده مستقیم از ژن‌های مرجع، روش‌های پیشرفته‌تری نیز در این خانواده وجود دارند که مرجع را به صورت آماری از خود داده‌ها استخراج می‌کنند. این روش‌ها معمولا در داده‌های بزرگ مانند RNA‑seq، متاژنومیکس یا پروتئومیکس استفاده می‌شوند. در چنین داده‌هایی به جای انتخاب یک ژن خاص، از رفتار کلی تعداد زیادی از ژن‌ها برای ساختن یک مرجع پایدار استفاده می‌شود. این کار کمک می‌کند اثر ژن‌هایی که تغییرات بسیار شدید دارند کاهش یابد و فاکتور نرمال‌سازی دقیق‌تری محاسبه شود. چند روش شناخته‌شده در این خانواده عبارت‌اند از:

• DESeq Median of Ratios
• TMM (Trimmed Mean of M values)
• Housekeeping gene normalization
• Spike‑in based normalization
• Pseudo reference–based scaling

روش DESeq Median of Ratios یکی از روش‌های پرکاربرد در تحلیل داده‌های RNA‑seq است. در این روش ابتدا یک مرجع فرضی از داده‌ها ساخته می‌شود و سپس برای هر نمونه نسبت بیان ژن‌ها نسبت به این مرجع محاسبه می‌شود. در نهایت میانه این نسبت‌ها به عنوان فاکتور نرمال‌سازی آن نمونه در نظر گرفته می‌شود. استفاده از میانه باعث می‌شود مقادیر بسیار بزرگ یا ژن‌هایی که تغییرات شدید دارند تاثیر کمتری بر نتیجه نهایی داشته باشند.

روش TMM نیز ایده‌ای مشابه دارد اما به شکل متفاوتی مقادیر بسیار بزرگ را کنترل می‌کند. در این روش ابتدا ژن‌هایی که اختلاف‌های بسیار شدید دارند حذف یا «trim» می‌شوند و سپس میانگین اختلاف‌های باقی‌مانده برای محاسبه فاکتور نرمال‌سازی استفاده می‌شود. این کار باعث می‌شود تغییرات غیرعادی یا بسیار بزرگ نتوانند مقیاس کل داده را تحت تاثیر قرار دهند.

در برخی آزمایش‌ها نیز از مولکول‌های استانداردی استفاده می‌شود که مقدار مشخصی از آن‌ها به نمونه اضافه می‌شود. این مولکول‌ها که به آن‌ها spike‑in گفته می‌شود، به عنوان یک مرجع خارجی برای نرمال‌سازی استفاده می‌شوند. چون مقدار واقعی آن‌ها از قبل مشخص است، می‌توان از آن‌ها برای تشخیص اختلاف‌های فنی بین نمونه‌ها کمک گرفت.

در نهایت، در برخی روش‌ها نیز یک مرجع آماری از خود داده‌ها ساخته می‌شود که گاهی به آن pseudo reference گفته می‌شود. در این حالت الگوریتم تلاش می‌کند یک نمونه مرجع فرضی ایجاد کند که نماینده رفتار کلی داده‌ها باشد. سپس سایر نمونه‌ها نسبت به این مرجع تنظیم می‌شوند.

با وجود مزایای این روش‌ها، انتخاب مرجع مناسب همچنان اهمیت زیادی دارد. برای مثال همه ژن‌هایی که به عنوان housekeeping gene شناخته می‌شوند در تمام شرایط کاملا پایدار نیستند. در برخی بافت‌ها یا شرایط بیماری ممکن است بیان آن‌ها نیز تغییر کند. به همین دلیل در بسیاری از مطالعات توصیه می‌شود قبل از انجام نرمالیزیشن، پایداری ژن‌های مرجع یا فرضیات روش مورد استفاده بررسی شود. این کار کمک می‌کند فرآیند Data normalization با دقت بیشتری انجام شود و نتایج قابل اعتماد‌تری به دست آید.

۳) روش‌های Distribution Matching

در برخی داده‌های زیستی، مشکل فقط تفاوت در مقدار کل داده بین نمونه‌ها نیست. گاهی شکل کلی توزیع داده‌ها نیز در نمونه‌های مختلف با یکدیگر تفاوت دارد. به عبارت دیگر، ممکن است مقادیر داده در یک نمونه بیشتر در محدوده‌های خاصی متمرکز شده باشند، در حالی که در نمونه دیگر الگوی متفاوتی دیده شود. در چنین شرایطی حتی اگر مقدار کل داده‌ها نیز مشابه باشد، مقایسه مستقیم داده‌های خام می‌تواند نتایج گمراه‌کننده‌ای ایجاد کند.

برای مثال فرض کنید شدت بیان هزاران ژن در چند نمونه اندازه‌گیری شده است. در یک نمونه ممکن است بیشتر ژن‌ها مقادیر متوسطی داشته باشند، در حالی که در نمونه دیگر تعداد کمی ژن با بیان بسیار بالا وجود داشته باشد. حضور چنین مقادیر بزرگی می‌تواند شکل کلی توزیع داده‌ها را تغییر دهد و باعث ایجاد عدم تقارن یا پراکندگی متفاوت در توزیع شود. در نتیجه مقایسه مستقیم مقادیر بین نمونه‌ها دشوارتر خواهد شد.

برای کاهش این مشکل، گروهی از روش‌های Data normalization توسعه یافته‌اند که هدف آن‌ها نزدیک کردن شکل توزیع داده‌ها در نمونه‌های مختلف است. این روش‌ها که به طور کلی Distribution Matching normalization نامیده می‌شوند، تلاش می‌کنند داده‌ها را به گونه‌ای تنظیم کنند که توزیع آماری آن‌ها در همه نمونه‌ها تا حد زیادی مشابه شود. در نتیجه، اثر تفاوت‌های فنی در فرآیند اندازه‌گیری کاهش پیدا می‌کند و مقایسه بین نمونه‌ها قابل اعتمادتر می‌شود.

یکی از شناخته‌شده‌ترین روش‌ها در این گروه Quantile normalization است. این روش ابتدا مقادیر داده‌ها را در هر نمونه مرتب می‌کند. سپس مقادیر دارای رتبه مشابه در نمونه‌های مختلف با یکدیگر مقایسه می‌شوند و میانگین یا میانه آن‌ها محاسبه می‌شود. در مرحله بعد این مقادیر جدید جایگزین مقادیر اولیه می‌شوند. نتیجه این فرآیند این است که توزیع مقادیر در همه نمونه‌ها یکسان می‌شود، در حالی که ترتیب نسبی مقادیر در هر نمونه حفظ می‌شود.

Quantile normalization به طور گسترده در تحلیل داده‌های microarray استفاده شده است و در برخی انواع دیگر داده‌های زیستی نیز کاربرد دارد. ایده اصلی این روش بر این فرض استوار است که در بیشتر آزمایش‌ها، بخش بزرگی از ژن‌ها یا مولکول‌ها تغییر قابل توجهی ندارند. بنابراین انتظار می‌رود توزیع کلی داده‌ها در نمونه‌های مختلف تا حد زیادی مشابه باشد. با یکسان کردن این توزیع، بسیاری از تفاوت‌های ناشی از عوامل فنی کاهش پیدا می‌کنند.

با این حال، استفاده از این روش‌ها همیشه بدون محدودیت نیست. اگر در یک آزمایش واقعا تعداد زیادی از ژن‌ها یا مولکول‌ها دچار تغییرات زیستی گسترده شده باشند، اعمال روش‌های Distribution Matching ممکن است بخشی از این تفاوت‌های واقعی را نیز کاهش دهد. به همین دلیل انتخاب این روش‌ها باید با توجه به نوع داده، طراحی آزمایش و هدف تحلیل انجام شود.

در کنار Quantile normalization، چند روش دیگر نیز در این خانواده قرار می‌گیرند که همگی با هدف هم‌تراز کردن یا نزدیک کردن توزیع داده‌ها در نمونه‌های مختلف توسعه یافته‌اند. برخی از روش‌های پرکاربرد در این گروه عبارت‌اند از:

• Quantile normalization
• Cyclic loess normalization
• Loess normalization
• Rank‑based normalization

۴) روش‌های Variance Stabilizing Transformations

در بسیاری از داده‌های زیستی، به‌ویژه داده‌های مبتنی بر شمارش مانند RNA‑seq، یکی از مشکلات مهم این است که واریانس داده‌ها به مقدار میانگین آن‌ها وابسته است. به عبارت دیگر، ژن‌هایی که مقدار بیان بالاتری دارند معمولا نوسان یا واریانس بیشتری نیز نشان می‌دهند. این ویژگی که به آن mean‑variance relationship گفته می‌شود باعث می‌شود مقایسه داده‌ها و استفاده از بسیاری از روش‌های آماری کلاسیک دشوارتر شود.

بسیاری از روش‌های آماری فرض می‌کنند که واریانس داده‌ها در تمام محدوده مقادیر تقریبا ثابت است. اما در داده‌های شمارشی زیستی، این فرض اغلب برقرار نیست. در چنین شرایطی اگر داده‌ها مستقیما در تحلیل‌های آماری یا روش‌های یادگیری ماشین استفاده شوند، ژن‌هایی با مقادیر بزرگ می‌توانند تاثیر نامتناسبی بر نتایج داشته باشند برای حل این مشکل، گروهی از روش‌های Data normalization توسعه یافته‌اند که به آن‌ها Variance Stabilizing Transformations (VST)  گفته می‌شود. هدف این روش‌ها تبدیل داده‌ها به شکلی است که واریانس آن‌ها در محدوده‌های مختلف مقدار بیان تا حد ممکن یکنواخت شود. به بیان ساده، این تبدیل‌ها تلاش می‌کنند رابطه بین میانگین و واریانس را کاهش دهند تا داده‌ها برای تحلیل‌های بعدی مناسب‌تر شوند.

یکی از ساده‌ترین و پرکاربردترین تبدیل‌ها در این زمینه تبدیل لگاریتمی (log transformation)  است. در این روش مقادیر داده‌ها به صورت لگاریتمی تبدیل می‌شوند. این کار باعث می‌شود اختلاف بین مقادیر بسیار بزرگ و مقادیر کوچک کاهش یابد و پراکندگی داده‌ها متعادل‌تر شود. در بسیاری از تحلیل‌های داده‌های بیان ژن از تبدیل‌هایی مانند log2(x + 1) استفاده می‌شود تا از مشکل لگاریتم صفر نیز جلوگیری شود. با این حال، تبدیل لگاریتمی همیشه برای همه انواع داده‌ها کافی نیست. به همین دلیل روش‌های پیشرفته‌تری نیز توسعه یافته‌اند که به طور خاص برای داده‌های شمارشی زیستی طراحی شده‌اند. این روش‌ها تلاش می‌کنند بر اساس مدل آماری داده‌ها، تبدیلی اعمال کنند که واریانس را در محدوده‌های مختلف مقدار بیان پایدارتر کند.

برای مثال در تحلیل داده‌های RNA‑seq، برخی ابزارهای بیوانفورماتیکی تبدیل‌های خاصی برای پایدارسازی واریانس ارائه کرده‌اند. این تبدیل‌ها معمولا با در نظر گرفتن ویژگی‌های آماری داده‌های شمارشی مانند توزیع منفی دوجمله‌ای طراحی شده‌اند و می‌توانند داده‌ها را برای تحلیل‌هایی مانند خوشه‌بندی، کاهش بُعد و visualization مناسب‌تر کنند. از جمله روش‌های شناخته‌شده در این گروه می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

• Log transformation (مانند log2(x+1))
• Variance Stabilizing Transformation (VST) در ابزار DESeq
• Regularized log transformation (rlog) در DESeq2
• Variance Stabilizing Normalization (VSN)

این روش‌ها معمولا در مراحل اولیه تحلیل داده‌های بیان ژن استفاده می‌شوند، به‌ویژه زمانی که هدف انجام تحلیل‌های اکتشافی مانند PCA، clustering یا heatmap visualization باشد. در چنین تحلیل‌هایی پایدار بودن واریانس داده‌ها اهمیت زیادی دارد، زیرا می‌تواند بر نحوه گروه‌بندی نمونه‌ها و تفسیر الگوهای داده تاثیر بگذارد. با وجود مزایای این تبدیل‌ها، باید توجه داشت که آن‌ها ماهیت داده‌ها را تغییر می‌دهند. به همین دلیل در برخی تحلیل‌ها، به‌ویژه روش‌هایی که مستقیما برای داده‌های شمارشی طراحی شده‌اند، ممکن است استفاده از داده‌های خام همراه با مدل‌های آماری مناسب ترجیح داده شود. بنابراین، انتخاب استفاده از Variance Stabilizing Transformations باید با توجه به نوع تحلیل و ویژگی‌های داده‌ها انجام شود.

۵) روش‌های Rank‑Based یا Non‑Parametric

در برخی تحلیل‌های داده‌های زیستی، مقادیر واقعی داده‌ها ممکن است به شدت تحت تاثیر نویز، مقادیر بسیار بزرگ (outliers) یا تفاوت در مقیاس اندازه‌گیری قرار داشته باشند. در چنین شرایطی استفاده مستقیم از مقادیر عددی خام می‌تواند باعث شود برخی نقاط داده تاثیر بیش از حدی بر نتایج تحلیل داشته باشند. برای کاهش این مشکل، گروهی از روش‌های Data normalization توسعه یافته‌اند که به جای استفاده از مقدار دقیق داده‌ها، از رتبه (rank) آن‌ها استفاده می‌کنند.

ایده اصلی در این روش‌ها این است که به جای تمرکز بر مقدار مطلق هر داده، ترتیب نسبی آن‌ها در میان سایر داده‌ها در نظر گرفته شود. به بیان ساده، داده‌ها بر اساس مقدارشان مرتب می‌شوند و سپس هر مقدار با رتبه آن در توزیع داده‌ها جایگزین می‌شود یا بر اساس رتبه خود تبدیل می‌شود. با این کار تاثیر مقادیر بسیار بزرگ یا بسیار کوچک کاهش پیدا می‌کند و تحلیل داده‌ها نسبت به نویز یا outlierها مقاوم‌تر می‌شود.

برای مثال فرض کنید در یک مجموعه داده بیان ژن، چند ژن دارای مقادیر بسیار بزرگ هستند که می‌توانند تحلیل آماری را تحت تاثیر قرار دهند. اگر به جای مقادیر واقعی، رتبه بیان ژن‌ها استفاده شود، این مقادیر بسیار بزرگ دیگر نمی‌توانند به طور نامتناسب بر نتیجه تاثیر بگذارند، زیرا فقط ترتیب آن‌ها در میان سایر ژن‌ها در نظر گرفته می‌شود.

روش‌های Rank‑based اغلب زمانی مفید هستند که توزیع داده‌ها نامتقارن باشد یا فرضیات آماری روش‌های پارامتریک درباره شکل توزیع داده برقرار نباشد. به همین دلیل این روش‌ها در بسیاری از تحلیل‌های آماری غیرپارامتریک و همچنین در برخی الگوریتم‌های یادگیری ماشین استفاده می‌شوند. یکی از روش‌های ساده در این گروه Rank transformation است. در این روش، داده‌ها ابتدا مرتب می‌شوند و سپس هر مقدار با رتبه آن در مجموعه داده جایگزین می‌شود. این کار باعث می‌شود داده‌ها به یک مقیاس یکنواخت تبدیل شوند که فقط ترتیب نسبی آن‌ها را نشان می‌دهد. روش رایج دیگر Rank‑based inverse normal transformation (INT)  است. در این روش ابتدا داده‌ها به رتبه تبدیل می‌شوند و سپس این رتبه‌ها به مقادیر متناظر در یک توزیع نرمال تبدیل می‌شوند. هدف این تبدیل این است که داده‌ها تا حد امکان به توزیع نرمال نزدیک شوند تا بتوان از روش‌های آماری که به این فرض وابسته‌اند استفاده کرد.

مزیت مهم روش‌های Rank‑based این است که نسبت به مقادیر بسیار بزرگ، خطاهای اندازه‌گیری و توزیع‌های غیرنرمال حساسیت کمتری دارند. با این حال، این روش‌ها نیز محدودیت‌هایی دارند. چون اطلاعات مربوط به فاصله واقعی بین مقادیر داده‌ها از بین می‌رود، ممکن است بخشی از اطلاعات کمی موجود در داده‌ها نیز حذف شود. برخی از روش‌های رایج در این خانواده عبارت‌اند از:

• Rank transformation
• Rank‑based inverse normal transformation (INT)
• Van der Waerden normalization
• Blom transformation
• Quantile rank transformation

۶) روش‌های Batch Effect Correction و Unwanted Variation

در بسیاری از مطالعات زیستی، داده‌ها در چندین مرحله آزمایشگاهی، در زمان‌های مختلف یا حتی در آزمایشگاه‌های متفاوت تولید می‌شوند. این شرایط می‌تواند باعث ایجاد اختلافات سیستماتیک در داده‌ها شود که به آن‌ها Batch effects گفته می‌شود. این اختلافات معمولا ناشی از عوامل فنی هستند، نه تفاوت‌های واقعی زیستی.

اگر در مورد مفهوم Batch effects اطلاعات کافی ندارید، این مقاله از وبلاگ می‌تواند به شما کمک کند.

برای مثال ممکن است بخشی از نمونه‌ها در یک روز خاص توالی‌یابی شده باشند و بخش دیگری در روزی دیگر، یا از دستگاه‌ها و کیت‌های متفاوتی برای اندازه‌گیری آن‌ها استفاده شده باشد. این تفاوت‌های فنی می‌توانند باعث شوند که نمونه‌ها بر اساس Batch آزمایشگاهی از هم جدا شوند، حتی اگر از نظر زیستی مشابه باشند. چنین اثری می‌تواند تحلیل‌های بعدی مانند خوشه‌بندی، PCA یا تحلیل بیان تفاضلی ژن‌ها را به شدت تحت تاثیر قرار دهد.

به همین دلیل، یکی از مراحل مهم در پیش‌پردازش داده‌های زیستی شناسایی و اصلاح این نوع تغییرات ناخواسته است. روش‌هایی که برای این منظور استفاده می‌شوند معمولا در دسته Batch Effect Correction یا Unwanted Variation Correction قرار می‌گیرند. هدف این روش‌ها حذف یا کاهش تغییرات فنی در داده‌ها است، در حالی که سیگنال‌های زیستی واقعی حفظ شوند.

یکی از شناخته‌شده‌ترین روش‌ها در این زمینه ComBat است. این روش که در پکیج sva در زبان R پیاده‌سازی شده است، با استفاده از یک مدل آماری تلاش می‌کند اثر Batch را از داده‌ها جدا کرده و آن را اصلاح کند. ComBat با تخمین پارامترهای مربوط به هر Batch، مقادیر داده‌ها را به گونه‌ای تنظیم می‌کند که اختلافات ناشی از شرایط آزمایشگاهی کاهش یابد. از جمله روش‌های رایج در این گروه می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

• ComBat
• Surrogate Variable Analysis (SVA)
• Remove Unwanted Variation (RUV)
• Harman normalization
• limma removeBatchEffect

جمع‌بندی

انجام نرمالیزیشن، بخش مهمی از آنالیزهای بیولوژیکی و بیوانفورماتیکی به شمار می‌رود. بنابراین،  با مطالعه و درک جزئی هریک از روش‌ها، می‌توانید کیفیت آنالیزهای خود را افزایش دهید. نکات ارائه شده در این مقاله و دسته‌بندی پیشنهادی، صرفا سرآغازی برای یادگیری بیشتر شما بود و امیدواریم که به منظم ساختن ذهن شما پیرامون انبوه روش‌های نرمالیزیشن کمک کرده باشد. ممکن است در منابع و رفرنس‌های مختلف، نوع دیگری از گروه‌بندی را مشاهده کنید و تلاش این مقاله بر این بود که یک گروه‌بندی گسترده را پیرامون این روش‌ها ارائه کند.