تکنیک PCR چیست؟

تاریخچه تکنیک PCR

تکنیک Polymerase Chain Reaction یا به اختصار PCR یکی از تکنیک های مهم و پرکاربرد در بیولوژی مولکولی است. با کمک PCR می‌توان تعداد قابل توجهی نسخه، از یک قطعه DNA را در محیط آزمایشگاه تکثیر کرد. ابداع این تکنیک توسط آقای Kary Mullis در دهه ۱۹۸۰میلادی صورت پذیرفت و به خاطر این دستاورد، ایشان موفق به دریافت جایزه نوبل نیز گردید. زمانی که آقای مولیس PCR را در سال ۱۹۸۳ توسعه داد، در شرکت Cetus، یکی از اولین شرکت های بیوتکنولوژی، مشغول به کار بود. او در این شرکت مسئولیت سنتز زنجیره های کوتاه DNA را برعهده داشت. به گفته آقای مولیس، او ایده PCR را در حالی که یک شب با ماشین خود در امتداد بزرگراه ساحلی اقیانوس آرام در حال گشت و گذار بود، در ذهن شکل داده است. در آن لحظه وی مشغول ایده پردازی پیرامون رسیدن به راهی برای بررسی جهش‌های مولکولی بود، اما به خود آمد و دید که روشی را برای سنتز رشته DNA ابداع کرده است. آقای مولیس در Scientific American این روش را به این شکل خلاصه کرد: «با شروع با یک مولکول DNA، روش PCR می تواند ۱۰۰ میلیارد مولکول مشابه را در یک بعد از ظهر تولید کند. انجام واکنش آسان است. به بیش از یک لوله آزمایش نیاز ندارد. چند معرف ساده و منبع گرما.»

از سال ۱۹۸۳ به بعد، این تکنیک به مرور در کاربردهای گوناگونی مورد استفاده قرار گرفت و انواع تخصصی‌تری از آن با مقاصد مختلف ایجاد شدند. پایه و اساس مهندسی ژنتیک مدرن، تا حد بسیار زیادی وابسته به PCR است. تقریبا اکثر مطالعات و دستکاری‌های مختلف در مطالعات زیستی، نیازمند داشتن مقدار قابل توجهی از توالی هدف هستند. رسیدن به این میزان از توالی مورد نیاز نیز به واسطه PCR امکان پذیر است.

اساس واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)

این تکنیک در واقع یک نوع فرآیند شبیه سازی شده از همانندسازی DNA در سلول است. با این تفاوت که در آزمایشگاه، با هدف قرار دادن بخشی از DNA، تکثیر از یک ناحیه مشخص صورت می‌گیرد. همچنین تعداد نسخه های تکثیر یافته، بسیار بیشتر از نسخه‌های موجود در بدن موجود زنده است. در حقیقت این تکنیک، به صورت سیکل‌های پی در پی و به واسطه تغییرات دمایی از پیش برنامه ریزی شده، پیش می‌رود و در نهایت میلیاردها نسخه از قطعه DNA مورد نظر ساخته خواهد شد. با انجام PCR به مقدار کافی از DNA مورد هدف، جهت آنالیز های بعدی و کاربردهای دیگر خواهیم رسید. دو جز کلیدی واکنش PCR، آنزیم DNA پلی‌مراز مقاوم به حرارت و توالی‌هایی تحت عنوان پرایمر هستند.

اجزا مورد نیاز در PCR چیست؟

یک تیوب واکنش PCR حاوی ۴ بخش اصلی است:

• DNA الگو یا Template: همان DNA استخراج شده از منبع سلولی و بافتی که حاوی توالی مورد هدف ما برای تکثیر نسخه های جدید است.
• توالی‌های پرایمر : قطعات کوتاه الیگونوکلئوتیدی که معمولا ۱۸ تا ۲۵ نوکلئوتید طول دارند. برای هر واکنش دو نوع پرایمر Forward و Reverse طراحی شده که با اتصال به هریک از دو رشته DNA، محل تکثیر ژن را مشخص می‌کنند. همچنین با فراهم کردن انتهای ۳′-OH آزاد برای آنزیم پلی‌مراز، سنتز رشته جدی را امکان پذیر خواهند ساخت.
• مستر میکس (Master Mix) واکنش: این جز از PCR خود حاوی سایر اجزای ضروری برای انجام واکنش است. شامل آنزیم، داکسی ریبونوکلئوتیدها و… .
• آب: PCR در یک شرایطی آبی انجام می‌شود.

اجزای کلیدی در Master Mix واکنش:

• آنزیم DNA پلیمراز: این آنزیم، نوکلئوتیدها را بر اساس رابطه مکملی با رشته الگو به رشته در حال ساخت اضافه می‌کند. آنزیم مورد استفاده در PCR یک آنزیم مقاوم به حرارت است، آن هم به دلیل تغییرات دمایی طی واکنش و رسیدن به دمای ۹۵ درجه سانتی گراد. معروف‌ترین آنزیم مورد استفاده از PCR های معمولی، Taq DNA Polymerase است. آنزیم یاد شده از باکتری Thermus aquaticus به دست آمده است. این باکتری در چشمه‌های آب گرم زندگی می‌کند و در نتیجه پلیمراز استخراج شده از آن، در برابر حرارت بسیار پایدار است.
• داکسی ریبونوکلئوتیدها (dNTPs): سنتز رشته جدید، نیازمند dNTP هاست. این‌ها به عنوان واحدهای مولکولی سازنده رشته های جدید DNA، توسط آنزیم پلیمراز مورد استفاده قرار می گیرند و شامل چهار نوع dATP، dGTP، dCTP و dTTP می باشند.
• بافر واکنش: pH مناسب را برای فعالیت بهینه آنزیم تا پایان واکنش فراهم می‌کند.
• MgCl2: وجود منیزیم برای فعالیت آنزیم مورد نیاز است و به عنوان کوفاکتور آن عمل می‌کند. همچنین سبب پایداری ساختار DNA، و تسهیل اتصال پرایمر به جایگاه هدف خود نیز خواهد شد. یکی از کارهای کلیدی در طی آماده سازی مستر میکس PCR، تنظیم غلظت MgCl2 است.

نکته: امروزه اکثر افراد به منظور انجام PCR از Master Mix های آماده و تجاری استفاده می‌کنند. در صورتی که از چنین مسترمیکس‌هایی استفاده شود، تنها کافیست Template، پرایمر و آب در کنار مستر میکس به تیوب واکنش اضافه شده و با هم مخلوط گردند. اما در بعضی شرایط، بسته به نیاز ممکن است اجزا مسترمیکس به شکل جداگانه تهیه شده و با هم مخلوط شوند. به خصوص زمانی که قصد بهینه سازی PCR را داریم و تهیه اجزا مستر میکس به شکل جداگانه، فرصت بهینه سازی بیشتری را در اختیارمان قرار خواهد داد.

ویژگی‌های آنزیم مناسب برای PCR چیست؟

برای انتخاب آنزیم مناسب برای تکنیک PCR، باید به چهار معیار اساسی توجه کرد:

• اختصاصیت (Specificity): تکثیر محصولات غیر اختصاصی، مانند مناطق غیر هدف و یا تکثیر به دنبال تشکیل primer dimer، مشکلاتی است که ممکن است حین تکینک PCR به وجود آید. برخی آنزیم‌ها مانند Taq polymerase، امکان تکثیر مناطق غیر هدف را دارند. البته روش‌هایی مانند Hot start PCR برای جلوگیری از شروع فعالیت آنزیم‌ قبل از ورود به سیکل‌های PCR، یک روش مرسوم برای غلبه به چنین مشکلاتی می‌باشد. اما در کل اختصاصیت تکثیر آنزیم یک موضوع مهم و کلیدی است.
• مقاومت دمایی (Thermostability): این ویژگی اهمیت زیادی در PCR دارد. مثلاً، آنزیم Taq polymerase مقاومت دمایی مناسبی دارد، اما در واکنش‌های طولانی مدت، ممکن است فعالیت آن کاهش داشته باشد. برای واکنش‌های با شرایط دشوارتر، آنزیم‌هایی مانند Pfu انتخاب مناسب‌تری هستند.
• قدرت پردازش (Processivity): این ویژگی نشان‌دهنده سرعت و کارایی آنزیم در تولید DNA است. آنزیم‌هایی با قدرت پردازش بالا می‌توانند الگوهای با ساختارهای ثانویه پیچیده را نیز تکثیر کنند.
• صحت عملکرد (Fidelity): این ویژگی به توانایی آنزیم در تصحیح خطاهای ساختاری در طول تکثیر DNA اشاره دارد. آنزیم‌هایی با ویژگی proofreading مناسب برای حفظ دقت در تکثیر DNA هستند. برای مثال، آنزیم Pfu صحت عملکرد بالاتری نسبت به Taq polymerase دارد، اما سرعت تولید آن کمتر است.

مراحل انجام یک PCR چیست؟

هر سیکل از PCR شامل سه بخش کلیدی است:

• واسرشتگی (Denaturation)
• اتصال (Annealing)
• گسترش (Extension)

این سه مرحله در هر سیکل PCR، به دنبال هم تکرار شده تا بتوانیم به تعداد قابل توجهی از توالی مورد هدف دست یابیم. معمولا ۲۰ تا ۴۰ سیکل لازم است تا بتوان به میزان قابل قبولی از توالی مورد آزمایش رسید. این سیکل‌ها تحت عنوان سیکل‌های اصلی PCR شناخته می‌شوند. حال برای بهینه‌تر شدن فرآیند PCR، قبل و بعد از این سیکل‌ها نیز مراحلی در نظر گرفته می‌شوند. این مراحل شامل موارد زیر هستند:

• دناتوراسیون اولیه (Initial denaturation)
• طویل سازی نهایی (Final Extension)
• نگه‌داری نهایی (Hold)

دستگاه لازم جهت انجام PCR تحت عنوان ترموسایکلر شناخته می‌شود. برنامه مورد نیاز جهت انجام واکنش به این دستگاه داده شده و بعد از قرار دادن تیوب‌ها درون دستگاه و آغاز آن، فرآیند PCR شروع شده و بعد از گذشت چند ساعت، کار تکثیر به پایان خواهد رسید. در ادامه یک برنامه‌ مرسوم PCR به ترتیب مراحلی که لازم است طی شود را، مورد بررسی قرار خواهیم داد:

1. دناتوراسیون اولیه (Initial Denaturation): قبل از آغاز اولین چرخه دمایی، اجزای واکنش به مدت ۲ تا ۵ دقیقه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد باقی می‌مانند. هدف از این مرحله اطمینان از باز شدن کامل دو رشته الگو از هم و آماده‌سازی آن برای سیکل‌های تکثیر است. همچنین در شرایطی که از آنزیم‌های Hot start PCR استفاده می‌شود، زمان این مرحله بسته به توصیه سازنده آنزیم، متغیر بوده و می‌تواند باعث فعال شدن آنزیم شود.
2. سیکل‌های اصلی واکنش (۲۰-۴۰ سیکل):
   • دناتوراسیون (Denaturation): هدف از این مرحله این است که دو رشته DNA سنتز شده در هر سیکل، از هم جدا شوند (معمولا ۱۵ تا ۳۰ ثانیه در دمای ۹۵ درجه).
   • اتصال (Annealing): هدف از این مرحله اتصال پرایمرها به رشته الگو است (معمولا ۳۰ ثانیه و دما نیز بسته به دمای مورد نیاز جهت اتصال پرایمر بسته به طراحی انجام شده).
   • گسترش (Extension): هدف از این مرحله تکثیر رشته جدید به واسطه آنزیم است (اگر از آنزیم Taq DNA Polymerase استفاده می‌شود، دمای بهینه فعالیت آن ۷۲ درجه سانتی‌گراد است، اما با بسته به آنزیم ممکن است دمای این مرحله متفاوت Set شود. همچنین زمان این مرحله نیز بسته به سایر توالی مورد هدف متغیر خواهد بود).
3. طویل سازی نهایی (Final Extension): پس از انجام آخرین چرخه دمایی، تیوب واکنش به مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد (یا هر دمایی که در مرحله Extension به دستگاه داده شده است) باقی می‌ماند. این مرحله، زمان لازم را جهت تکمیل ساخت رشته‌های ناقص توسط آنزیم Taq پلیمراز، فراهم می‌سازد.
4. نگه‌داری نهایی (Hold): پس از پایان واکنش، میکروتیوب‌های واکنش، برای این‌که به دمای پایین برسند و فرآیند، به شکل ناگهانی در دمای بالا به پایان نرسد، در دمای پایین‌تری باقی می‌مانند (مثلا ۲۵ یا ۴ درجه سانتی‌گراد)، تا بتوانیم از آن‌ها در ادامه آزمایش استفاده کنیم (یا به یخچال یا فریزر منتقل شوند).

آنالیز نتایج PCR

بعد از اتمام PCR، میلیاردها نسخه از یک توالی هدف حاصل می‌شود. برای بررسی نتیجه، یک تکینک مرسوم انجام الکتروفورز ژل آگارز است. به این شکل که یک ژل آگارز با درصد مشخص ساخته خواهد شد. این ژل حاوی چاهک‌هایی به منظور Load کردن PCR Product است. در کنار PCR Product، یک Ladder نیز Load خواهد شد. اگر PCR به شکل اختصاصی انجام شده باشد، انتظار خواهیم داشت که موازی با مسیر حرکت DNA Ladder، یک باند در جایگاه سایزی مشخص دیده شود. ماهیت DNA Ladder به این شکل است که حاوی قطعات DNA با سایرهای مشخص است. مثلا از سایز ۱۰۰ نوکلئوتید تا ۱۰۰۰ نوکلئوتید. حال اگر قطعه ما یک توالی ۴۰۰ نوکلئوتیدی باشد، انتظار داریم موازی با قطعه ۴۰۰ در Ladder، یک باند مرتبط با محصول PCR خود را مشاهده کنیم.

در صورتی که باندهای دیگری در جاهای مختلف بر روی ژل آگارز مشاهده شود، بسته به وضعیت و جایگاه باند، تفسیر و تحلیل‌های گوناگونی خواهد شد. در این شرایط لازم است که به منظور رسیدن به یک تک باند بر روی ژل آگارز، واکنش بهینه شود. البته همیشه از بین بردن باندهای غیر اختصاصی ممکن است مورد نیاز نباشد و بسته به شرایط لازم است این کار صورت پذیرد.

جمع بندی و توصیه آموزشی

به صورت کلی اگر قصد یادگیری تکنیک‌های تخصصی PCR را دارید، داشتن یک دیدگاه حداقلی نسبت به Conventional PCR که در این مقاله پیرامون آن بحث شد می‌تواند مفید باشد. اگر دانشجوی علوم زیستی و علوم پایه پزشکی در هر گرایشی هستید، احتمالا در یک مرحله این تکنیک به کمک شما خواهد آمد و تسلط به آن خالی از لطف نیست. از انواع تخصصی این تکنیک، Real-Time PCR است که با دامنه وسیعی از کاربردها تبدیل به یکی از مهم‌ترین تکنیک‌های آزمایشگاهی در علوم زیستی شده است. پس می‌توانید در صورت مرتبط بودن با فیلد کاری، یادگیری این تکنیک را نیز در دستور کار قرار دهید. یک منبع عالی جهت یادگیری Real-Time PCR، این آموزش است. فراموش نکنید که صبر و حوصله در تست‌های این چنینی یک پارامتر بسیار مهم جهت رسیدن به نتیجه با کیفیت و عالی است.