باند Blurred (تار و مبهم) در وسترن بلات

حین انجام مراحل مختلف وسترن بلات، ممکن است با مشکلات متعددی رو به رو شویم. یکی از این مشکلات مشاهده باند تار و مبهم در ژل الکتروفورز است. چنین باندی عملا ادامه مسیر وسترن بلات را برای ما ناممکن می سازد. به همین جهت در ادامه نکاتی که می تواند به رفع این مشکل کمک کند را بررسی خواهیم کرد.

بررسی نمونه مورد استفاده در وسترن بلات

اگر نمونه‌ پروتئینی شما حین کار دچار تخریب و یا گلیکوزیلاسیون آن دچار تغییر شده باشد، می تواند باند تار ایجاد کند. تصور کنید که نمونه‌ ای واحد را با ژل‌ های مختلف و یا با آنتی بادی‌های متفاوت مورد بررسی قرار داده اید. نتیجه یک بار خوب و مرتبه‌ بعد نامناسب بوده است و به باندی تار و مبهم رسیده اید. در چنین حالتی مشکل باند تار، به نمونه مرتبط نیست. این مشکل می‌تواند ناشی از SDS-PAGE بوده و یا به فرایند انتقال پروتئین از ژل به غشا مرتبط باشد.

دلایل مرتبط با SDS-PAGE

1- پروتئین با وزن مولکولی کم

در کار با پروتئینی که میدانیم وزن مولکولی کمی دارد، باید از همان اول احتمال ایجاد باند مبهم و تار را بدهیم. به این ترتیب تخلخل ژل مورد استفاده برای الکتروفورز باید متناسب با اندازه‌ی پروتئین هدف باشد. همچنین در انتخاب نوع غشا (نیتروسلولز – PVDF)  باید دقت شود، این غشا نیز باید متناسب با پروتئین هدف انتخاب شود.

۲- بافر رانینگ

باید اطمینان حاصل کرد که بافر رانینگ مورد استفاده، بافر ۱X باشد.

۳- تنظیم مقدار SDS

مقدار SDS مورد استفاده اگر برای کار شما زیاد باشد باند تار ایجاد می‌کند. SDS مازاد با پروتئین‌هایی که وزن مولکولی پایینی دارند واکنش نشان داده، و باندهای درهم و بر هم (Fuzzy) ایجاد می‌کنند.

۴- ولتاژ

کار در ولتاژ بالا باعث کدورت و توربیدیتی در نتیجه‌ی وسترن بلات می‌شود.

۵- Gradient gel

اگر تمامی نکات گفته شده مورد بررسی قرار گرفت و باز‌ نتیجه مناسب حاصل نشد، می‌توان از ژل گرادیانت استفاده کرد.

موارد مرتبط با انتقال پروتیئن از ژل به غشا

۱- تعداد کاغذ بلاتینگ (Blotting paper)

هنگام چینش ساندوریچ وسترن بلات (به ترتیب از پایین به بالا: فوم، کاغذ بلاتینگ، ژل، غشا، کاغذ بلاتینگ، فوم ) میتوان تعداد کاغذ بلاتینگ را افزایش داد. نکته ای که در اینجا مطرح می‌باشد این است که با افزایش تعداد لایه‌ها باید زمان انتقال نیز طولانی شود.

۲- شیوه‌ی اتصال لایه‌ها به یکدیگر

به چیدمان ساندویچ دقت کنید. نیازی نیست که لایه‌ها بسیار محکم به یکدیگر چسبیده باشند و البته این اتصال نباید سست باشد. برای اتصال مناسب لایه ها به یک دیگر، معمولا بعد از قرار گرفتن هر لایه از حرکات ملایم رفت و برگشتی یک رورل کمک گرفته می‌شود. رورل علاوه بر اینکه اتصال مناسبی بین لایه‌ها بر قرار می‌کند، حباب‌های ایجاد شده بین لایه‌ها نیز از بین می‌رود.