تکنیک Microarray چیست و چه کاربردی دارد؟

اگر سلول را به مانند یک جعبه سیاه تصور کنیم، برخی از روش‌های آزمایشگاهی در دنیای امروز می‌توانند این جعبه سیاه را تبدیل به جعبه‌ای شفاف جهت انجام مطالعات گوناگون کنند. درک چگونگی سازوکار درون سلولی و کشف روابط بین اجزا، می‌تواند سبب مدیریت بهتر شرایط به خصوص شناسایی علل و کنترل بیماری های مختلف شود. هزاران ژن درون یک واحد سلولی با همکاری یکدیگر سبب زیستن و تولید سلول‌های جدید می‌شوند. نظم بی‌نظیر و حاکم بر این واحدهای کوچک زیستی، امکان انجام فعالیت‌های اختصاصی را به آن‌ها می‌دهد و طی سالیان اخیر میلیون‌ها پژوهشگر در سراسر دنیا مشغول طراحی و انجام مطالعاتی با هدف درک بهتر آن بوده‌اند. طبیعتا به منظور مطالعه اجزای زیستی، داشتن امکانات آزمایشگاهی که اجازه جمع‌آوری داده کافی را دهد، یک امر حیاتی است. تکنولوژی‌های آزمایشگاهی طی دهه‌های گذشته روند رو به رشدی را تجربه کرده اند و پیشرفت در این ابزارها، امکان مطالعه هرچه بهتر و دقیق‌تر اجزا و پدیده‌های زیستی را فراهم کرده است. یکی از این تکنولوژی‌های جذاب، میکرواری یا ریزآرایه است. در این مقاله قصد داریم تا نگاه جامعی نسبت به تکنیک Microarray داشته باشیم و کاربردها و نحوه استفاده از داده‌های حاصل از آن را به تفصیل مورد بررسی قرار خواهیم داد.

نگاهی به تاریخچه و معرفی تکنیک Microarray

میکرواری به عنوان یک نوع آزمایشگاه بر روی تراشه شناخته می‌شود. هدف از پیدایش این تکنولوژی بررسی همزمانِ بیان هزاران ژن است. همانطور که می‌دانید، یکی از فاکتورهای بررسی بیان ژن، بررسی میزان RNA تولید شده از آن ژن می‌باشد. تکنیک‌های گوناگونی به منظور بررسی میزان RNA تولید شده، وجود دارند. یکی از معروف ترین این تکنیک‌ها، Real-time PCR است. اما با کمک Real-time PCR، تنها می‌توان تعداد محدودی از ژن ها را مورد بررسی قرار داد و برای بررسی بیان تمامی ژن‌ها، به نمونه اولیه بسیار زیادی نیاز است. تکنولوژی‌های با عملکرد بالا، همچون تکنیک Microarray، به ما این امکان را می‌دهند که با استفاده از یک نمونه واحد، به بررسی بیان هزاران ژن در نمونه بپردازیم.

وقتی صحبت از میکرواری می‌شود، منظور یک چیپ کوچک آزمایشگاهی است که بر روی آن هزاران خانه وجود دارد و در هر یک از این خانه‌ها، پروب‌های اختصاصی یک ژن قرار گرفته‌اند. در صورت وجود ژن مدنظر در نمونه مورد مطالعه، توالی آن‌ها با این پروب‌ها هیبرید شده که در نهایت سبب ایجاد سیگنالی مبنی بر وجود و میزان آن RNA در نمونه، خواهد بود. در ادامه مراحل انجام یک آزمایش مبتنی بر تکنیک Microarray به تفصیل شرح داده شده است.

باید توجه داشت که میکرواری یک واژه کلی است، اما به دلیل استفاده بسیار گسترده آن در بررسی بیان ژن، زمانی که این واژه را به کار می‌بریم، اغلب منظورمان DNA microarray است که هدف اصلی‌اش همان بررسی بیان ژن، در نمونه مورد مطالعه است. انواع میکرواری‌ها برای بررسی پروتئین، پپتید، سلول، آنتی بادی و … نیز وجود دارند. مفهوم و روش مبتنی بر میکرواری، برای اولین بار در سال ۱۹۸۳ توسط Tse Wen Chang به شکل Antibody Microarray (همچنین به عنوان ماتریس آنتی بادی نیز نامیده می شود) در یک نشریه علمی و تعدادی پتنت معرفی و نشان داده شده است. اما صنعت “Gene Chip” پس از چاپ مقاله‌ای در مجله Science در سال ۱۹۹۵ توسط تیم‌های Ron Davis و Pat Brown در دانشگاه استنفورد، شروع به رشد قابل توجهی کرد. ظهور این تکنولوژی و تاسیس شرکت‌هایی همچون Affymetrix، Agilent و غیره، سبب تجاری سازی گسترده این فناوری و طراحی و توسعه میکرواری‌های مختلف با کاربردهای گوناگون شد.

دسته بندی تکنیک میکرواری

همان‌طور که پیش‌تر اشاره شد، زمانی که به میکرواری اشاره می‌شود، منظور DNA microarray است. اما باید توجه داشت که میکرواری انواع گوناگونی دارد و برای کاربردهای اختصاصی مختلفی می‌تواند مورد استفاده قرار گیرد. در ادامه لیستی از انواع میکرواری‌ها آورده شده است:

• DNA microarrays
• SNP microarrays
• Protein microarrays
• Peptide microarrays
• Tissue microarrays
• Cellular microarrays
• Chemical compound microarrays
• Antibody microarrays
• Glycan arrays

کاربردهای تکنیک Microarray

تکنیک میکرواری امروز کاربردهای گوناگون و گسترده‌ای پیدا کرده است و برای اهداف اختصاصی و متنوعی مورد استفاده قرار می‌گیرد. بین تمامی کاربردهای تکنیک Microarray، می‌توان گفت آنالیز بیان ژن در سلول‌های گوناگون، پرکاربردترین آن‌هاست. برای بررسی بیان ژن در سلول‌های مختلف، لازم است به ازای هر‌ ژن، پروب اختصاصی برای بررسی بیان آن طراحی و تولید شود و به شیوه‌ای در سطح چیپ میکرواری قرار گیرد. طبیعتا همین امر یک چالش و محدودیت را برای انجام تکنیک Microarray ایجاد می‌کرد. اما به دلیل قدمت بالای این تکنیک، طی سالیان قبل این محدودیت به خوبی پوشش داده شده است و امروز برای بررسی بیان ژن در ارگانیسم های گوناگون، چیپ‌های اختصاصی و متنوعی در دسترس هستند. اما سایر کاربردهای میکرواری چطور؟ در ادامه لیستی از سایر کاربردهای این تکنیک جذاب آورده شده اند:

• تشخیص بیماری‌های گوناگون: از ریزآرایه‌ها می توان برای تشخیص بیماری ها با شناسایی الگوی بیان ژن در بیماری‌های مختلف، به ویژه سرطان استفاده کرد.
• کشف و توسعه دارو: ریزآرایه ها با نشان دادن چگونگی تغییر بیان ژن در پاسخ به درمان دارویی، به شناسایی ژن‌هایی که اهداف دارویی هستند کمک می‌کنند.
• تحقیقات سم شناسی: می‌توان از میکرواری‌ها برای درک مکانیسم های سمیت و شناسایی مارکرهای (نشانگرهای) زیستی برای مواد سمی، استفاده نمود.
• تجزیه و تحلیل SNP: از ریزآرایه ها می توان برای بررسی پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی (SNPs) استفاده کرد.
• تشخیص پاتوژن‌ها: با استفاده از ریزآرایه‌ها، می‌توان عوامل بیماری‌زای مختلف مانند باکتری‌ها و ویروس‌ها را با شناسایی مواد ژنتیکی منحصربه‌فرد آن‌ها در یک نمونه شناسایی کرد.
• تحقیقات سرطان: ریزآرایه ها به طور گسترده در تحقیقات سرطان برای درک بهتر ماهیت بیماری و پیش بینی پاسخ‌های درمانی، استفاده می شوند.
• زیست‌شناسی تکاملی: محققان از تکنیک Microarray برای مطالعه تغییرات بیان ژن در طول تکامل ارگانیسم‌ها استفاده می‌کنند که به درک مسیرهای رشد و عملکرد ژن‌ها کمک می‌کند.
• مطالعات حوزه کشاورزی: می‌توان از ریزآرایه ها برای اهداف اصلاحی، مطالعات مقاومت در برابر بیماری ها و درک عوامل ژنتیکی که به کیفیت محصول کمک می‌کنند، استفاده کرد.
• پزشکی فردمحور: ریزآرایه‌ها با شناسایی پروفایل ژنتیکی هر فرد، می‌توانند خطرات یک بیماری و پاسخ درمانی را پیش بینی کرده و به این شکل به پزشکی فردمحور کمک کنند.

اساس تکنیک میکرواری

اساس کاری ریزآرایه، مبتنی بر هیبریداسیون است. در میکرواری، یک چیپ کوچک متشکل از هزاران خانه (تحت عنوان Spot شناخته می‌شوند) وجود دارد که قادر به شناسایی هزاران هدف در یک مرحله آزمایش است. هریک از این Spot ها به دلیل اینکه حاوی یک پروب اختصاصی است، قادر به شناسایی یک هدف به خصوص‌ (مثلا یک ژن خاص) می‌باشد. البته منظور تنها یک عدد پروب نیست، هزاران پروب با توالی یکسان در هریک از Spot ها قرار گرفته‌اند. یکی از عوامل اثرگذار در کیفیت میکرواری، توانایی شرکت تولید کننده در ساخت و قرار دادن دقیق این پروب‌ها بر سطح چیپ میکرواری، در هر یک از Spot‌ هاست. بعد از انجام عمل هیبریداسیون، چیپ میکرواری توسط دستگاهی مخصوص اسکن شده و تصویر آن مورد پردازش قرار می‌گیرد. شدت سیگنال ساطع شده از هر خانه، نمایان‌گر میزان وجود هدف مذکور در نمونه اولیه است. تصویر چیپ میکرواری، تبدیل به داده‌های عددی شده و در ادامه آنالیزهای گوناگونی به منظور تفسیر اطلاعات صورت می‌پذیرد.

مراحل انجام تکنیک Microarray

در این بخش قصد داریم به مراحل انجام میکرواری بپردازیم. با توجه به این‌که پرکاربردترین نوع میکرواری، DNA microarray هست، در ادامه نیز مراحل انجام این نوع از ریزآرایه‌ها ذکر شده است. اما باید توجه داشت که ماهیت و اساس میکرواری در سایر انواع نیز به نوعی همانند DNA microarray است. انجام یک میکرواری را می‌توان در دو مرحله آزمایشگاهی و نرم افزاری (محاسباتی) طبقه بندی کرد. در این بخش تمرکز اصلی بر مراحل آزمایشگاهی خواهد بود و در ادامه به بررسی گام‌های نرم افزاری خواهیم پرداخت. برای درک بهتر مراحل آزمایشگاهی این تکنیک، شرایطی مانند سرطان را در نظر بگیرید که در آن قصد داریم الگوی بیان ژن نمونه سرطانی را نسبت به حالت نرمال مورد بررسی قرار دهیم.

گام اول – نمونه‌گیری

طبیعتا بعد از مشخص شدن هدف مطالعه و میکرواری،‌ لازم است در اولین گام اقدام به نمونه گیری کنیم. در مورد سرطان، بسته به نوع سرطان، نمونه می‌تواند از بافت جامد یا مایعات بافتی باشد. چون هدف بررسی بیان ژن در حالت سرطان نسبت به نرمال است، به هر دو نمونه سرطانی و نرمال، نیاز داریم. در بعضی سرطان ها امکان اینکه نمونه‌گیری به شکل Pair یا Adjacent باشد وجود دارد و اگر این امکان بود، می‌توان به نتیجه بهتری دست یافت. منظور از Pair این است که بعد از تهیه بیوپسی از بافت سرطانی، از بافت نرمال مجاور در ارگانی که درگیر سرطان است نیز نمونه تهیه شود. البته استراتژی نمونه گیری کاملا وابسته به نوع مطالعه است و مورد اشاره شده تنها یک پیشنهاد برای مطالعات سرطانی است. همچنین کیفیت نمونه‌گیری و نگهداری از آن در موفقیت میکرواری نقش چشم‌گیری دارد.

گام دوم – استخراج RNA

با توجه به این‌که هدف ما بررسی بیان ژن در سطح RNA با کمک ریزآرایه است،‌ لازم است از نمونه‌های به دست آمده RNA را استخراج کنیم. به این منظور مرحله استخراج RNA دومین گام از انجام این تکنیک است.

گام سوم – سنتز cDNA و لیبل کردن توالی‌ها

در مرحله بعد، به دلیل ناپایداری RNA و همچنین نیاز به لیبل کردن توالی هر RNA، لازم است عمل سنتز cDNA صورت پذیرد. عمل سنتز cDNA به کمک آنزیم ترانسکریپتاز معکوس، صورت می‌پذیرد و بسته به برند میکرواری انتخابی، با استراتژی مشخص، لیبل مخصوص به توالی‌ها افزوده می‌شود. این لیبل‌ها معمولا فلورسنت بوده (مانند Cy3 و Cy5) و قابلیت سنجش میزان بیان پس از مرحله هیبریداسیون را فراهم می‌کنند.

گام چهارم – انجام هیبریداسیون

در مرحله بعد، cDNA های برچسب‌دار شده (معمولا با رنگ‌های فلورسنت) بر روی چیپ میکرواری ریخته می‌شوند تا با پروب‌های موجود بر روی چیپ هیبرید شوند. هر خانه از چیپ میکرواری حاوی پروب‌های اختصاصی برای یک ژن خاص است.

گام پنجم – اسکن چیپ میکرواری

پس از هیبریداسیون، چیپ میکرواری اسکن شده تا سیگنال‌های ساطع شده از هر خانه، خوانده شوند. شدت رنگ ساطع شده از هر خانه نشان دهنده میزان بیان آن ژن است. پس از اسکن چیپ، داده‌های عددی مرتبط با شدت بیان هر ژن و نیز اطلاعات تکمیلی مربوط به نمونه‌ها و پروب‌ها، به صورت جداول گوناگون تهیه شده و وارد فاز نرم افزاری برای انجام آنالیزها و محاسبات گوناگون خواهند شد.

یک تصویر اسکن شده از چیپ میکرواری

نکته مهم در مورد تکنیک Microarray

میکرواری از لحاظ لیبل کردن توالی‌ها به دو شیوه دو کاناله و تک کاناله، بسته به برند تولید کننده چیپ قابل انجام است. در نوع دو کاناله، نمونه سرطانی با یک رنگ و نمونه نرمال با رنگ دیگری لیبل می‌شوند و ترکیب هر دو توالی لیبل شده، بر روی یک چیپ ریخته می‌شود. اما در نوع تک کاناله، هر یک از نمونه ها بعد از لیبل شدن، به شیوه جداگانه‌ای بر روی چیپ‌های مجزا ریخته می‌شوند تا عمل هیبریداسیون صورت پذیرد.

آنالیز داده های میکرواری

آنالیز داده‌های حاصل از تکنیک Microarray، کاملا وابسته به استراتژی مطالعاتی بوده و طی سالیان اخیر، مسیرهای کاری گوناگونی جهت تفسیر و تحلیل نتایج میکرواری توسعه داده شده اند. اما به صورت کلی، دو مرحله اساسی در آنالیز داده های میکرواری وجود دارد:

گام اول – کنترل کیفی و پیش پردازش داده‌ها

باید توجه داشت که پس از انجام میکرواری، داده‌های حاصل اصطلاحا داده‌های خام خروجی دستگاه هستند. پس نمی‌توان به شکل مستقیم آنالیزهای تخصصی را روی این داده‌ها انجام داد و یک مرحله پیش پردازش داده‌ها لازم است انجام شود. این مرحله زمانی که بر روی تعداد نمونه‌های زیادی میکرواری انجام شده است، ضرورت بیشتری پیدا می‌کند. هدف از پیش پردازش داده‌ها، رسیدن به داده‌های قابل مقایسه از لحاظ آماری است. ممکن است خطاهای کاری و تفاوت‌های گوناگون بین نمونه‌ها، به شکلی سبب تولید داده‌های با کیفیت پایین شده باشد. با انجام محاسبات آماری مخصوص پیش پردازش داده‌ها، می‌توان داده‌های خام را به شکلی آماده سازی کرد که در ادامه محاسبات، بتوان نتیجه‌ای منطقی را به دست آورد. همچنین لازم است تمامی نمونه ها به شکلی کنترل کیفی شوند که اگر بودنشان در کنار سایر نمونه‌ها سبب آسیب به آنالیزهای بعدی میشد، از مطالعه کنار گذاشته شوند. در برخی شرایط حتی بعد از پیش پردازش داده‌های میکرواری نیز برخی از نمونه ها کیفیت لازم را برای بودن در آنالیز نهایی ندارند. به همین جهت انجام با حوصله مرحله کنترل کیفی ضروری است.

گام دوم – انجام آنالیز مورد هدف

در مرحله بعد لازم است بسته به هدف مطالعاتی، آنالیز نهایی را بر روی داده های حاصل از تکنیک Microarray، انجام دهیم. همانطور که اشاره شد، طی سالیان اخیر روش‌های گوناگونی جهت آنالیز داده‌های میکرواری توسعه داده شده‌اند. یکی از محبوب‌ترین و معروف‌ترین این آنالیزها، Differential gene expression analysis است. در این آنالیز، هدف شناسایی ژن‌های با بیان نامتعارف بین نمونه‌های مورد مقایسه است. به طور مثال، در مورد شرایط سرطان، هدف از انجام این آزمون،‌ شناسایی ژن‌های با بیان نامتعارف در حالت سرطانی، نسبت به حالت نرمال است.

این تصویر با کمک هوش مصنوعی DALL-E تولید شده است.

نکته مهم

برای کنترل کیفی، پیش پردازش و انجام آنالیز مورد هدف، نرم افزارها و ابزارهای گوناگونی در دسترس هستند. معروف ترین ابزار بدون نیاز به برنامه نویسی برای این هدف، GEO2R است. البته که این ابزار محدودیت‌های خود را نیز دارد. از GEO2R تنها برای آنالیز داده‌های از پیش موجود در GEO (یک دیتابیس معروف جهت نگه‌داری پروفایل های بیان ژنی) می‌توان استفاده کرد. همچنین داده‌های مورد استفاده در GEO2R نیز داده‌های از پیش پردازش شده بوده و امکان آنالیز بر روی داده‌های کاملا خام را فراهم نمی‌کند. به همین جهت در صورتی که قصد داریم تمامی مراحل ذکر شده را خود انجام دهیم، بهترین انتخاب استفاده از زبان برنامه نویسی R است. در صورتی که تمایل دارید تمامی گام‌های مرتبط با آنالیز داده‌های میکرواری، آن هم با ابزارهای گوناگون و زبان برنامه نویسی R را فرا گیرید، این دوره از دایا زیست فناوران، کامل‌ترین دوره‌ای است که می‌تواند نیاز شما در این زمینه را برطرف سازد.

برندهای تجاری تولید کننده میکرواری

طی سالیان گذشته، شرکت‌های مختلفی اقدام به تولید چیپ‌های میکرواری نموده‌اند. با توجه به حساس بودن طراحی و تولید این چیپ‌ها، چند برند در این زمینه شناخته شده‌تر هستند و اغلب داده‌های موجود در دیتابیس‌های مرتبط با میکرواری نیز با چیپ‌های تولید شده توسط این برندها به دست آمده‌اند. در ادامه لیستی از تولید کنندگان مختلف میکرواری آورده شده است:

• Affymetrix
• Agilent
• Illumina
• ArrayJet
• ArrayGen Technologies
• Microarrays Inc

جمع‌بندی و توصیه آموزشی

با توجه به اهمیت داده‌های حاصل از تکنیک Microarray در علم بیولوژی و دنیای امروز، تسلط بر آنالیز آن موردی است که انتظار می‌رود دانشجویان گرایش های زیست شناسی بسته به نیاز رشته تحصیلی خود، به آن توجه ویژه ای داشته باشند. داده‌های میکرواری در حوزه های مختلف به خصوص مباحث مرتبط با پزشکی و دارویی، اطلاعات با ارزشی را در اختیار قرار می‌دهند. پس علاوه بر انجام صحیح این تکنیک،‌ آنالیز اصولی داده‌های آن نیز موضوع بسیار مهمی است. با توجه به اینکه در داخل کشور امکان انجام این تست به دلیل گران بودن هزینه، برای هر تیم پژوهشی امکان پذیر نیست، می‌توان از داده‌های موجود در دیتابیس‌های مرتبط با میکرواری جهت انجام پژوهش‌ها و مطالعاتی که مبتنی بر پروفایل بیان ژنی هستند، استفاده نمود. پس اگر قصد دارید در مطالعات خود از این تکنیک استفاده بهینه‌ای ببرید، در ابتدا یادگیری زبان R و سپس یادگیری آنالیز داده‌های میکرواری را در دستور کار قرار دهید. هر دو این آموزش‌ها در آکادمی دایا زیست فناوران به شکل دوره‌های جامع و پروژه محور برای ثبت نام، موجود می‌باشند.